朱駿 楊仲南

①講師，②教授，上海師范大學，生命與環(huán)境科學學院，上海 200234

1 引言

被子植物的個體發(fā)育包括種子的形成、種子的萌發(fā)和幼苗成長為成熟植株等營養(yǎng)生長過程，以及開花授粉受精等生殖發(fā)育過程，形成孢子體—配子體—孢子體的世代交替。開花植物的授粉過程不僅是有性生殖的必要途徑，也是進化及對環(huán)境適應的基礎之一?；ǚ郾谑腔ǚ哿１砻娴囊粚訄杂捕哂姓承缘慕Y構，在保護花粉免受環(huán)境破壞、促進花粉與昆蟲以及花粉與柱頭之間的附著與識別等方面具有重要作用；因此花粉壁的發(fā)育是植物保證有性生殖的重要一環(huán)，對花粉壁發(fā)育的研究具有重大的理論意義。目前的研究表明，多數(shù)雄性不育的性狀都與花粉壁的不正常發(fā)育相關。

2 被子植物花粉壁概述

2.1 花粉壁的結構

在花藥的發(fā)育過程中，花粉粒的花粉壁沉積是最重要的事件之一?；ǚ郾谑且粚佑涉叻鬯睾屠w維素組成的特殊的細胞壁，其理化性質(zhì)非常穩(wěn)定。花粉壁在發(fā)育過程中維持小孢子膜的穩(wěn)定[1-2]，使得小孢子經(jīng)過兩次有絲分裂發(fā)育成為成熟花粉后，在脫離孢子體期間能夠保持水分維持其生殖活性，并抵御各種物理、化學及生物因素的侵擾。此外，花粉壁還參與授粉后花粉與柱頭相互識別的過程[3]?；ǚ郾诘慕Y構和成分遠比一般的植物細胞的細胞壁復雜，后者主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成。花粉壁分為花粉內(nèi)壁(intine)和花粉外壁(exine)兩層，其中外壁又分為兩層：有蜂窩狀的外壁外層(sexine)以及平坦的外壁內(nèi)層(nexine)。外壁內(nèi)層是在初生外壁降解以后形成的，作為外壁發(fā)育的骨架。外壁外層由網(wǎng)格狀結構的柱狀層(bacula)和頂蓋層(tectum)構成(圖 1)?；ǚ弁獗诘某煞种饕山q氈層細胞合成并分泌在藥室中，沉著在小孢子表面后形成高度復雜的網(wǎng)狀結構。花粉壁內(nèi)壁相對簡單，成分主要是纖維素、果膠和蛋白質(zhì)[4]。花粉外壁外還覆蓋有一層脂質(zhì)復合物，名為含油層(tryphine)或者花粉包被(pollen coat)，對花粉的受精信號識別以及對柱頭或昆蟲的附著很關鍵[5]。

2.2 花粉壁的成分

花粉外壁的化學成分主要為極端抗腐蝕的孢粉素類物質(zhì)(sporopollenin)，是由一些長鏈脂肪酸、氧化芬芳環(huán)以及苯基丙酸類物質(zhì)聚合而成[6]。最近一些研究結果使人們對另兩種由芳香族多聚物構成的細胞外基質(zhì)成分的結構及其生物合成的過程有了更深刻的認識。然而，由于小孢子和成熟花粉粒的發(fā)育過程中合成的細胞外基質(zhì)成分太少，并且對花粉外壁成分的分析存在諸多的技術局限，因此人們對花粉外壁以及孢粉素多聚物單體及其結構的了解非常有限[7-8]。從其他物種已知的信息中發(fā)現(xiàn)孢粉素多聚體的主要單體成分是無分支的多羥基長鏈或極長鏈的脂肪酸，以及氧化的芳香族復合物。由于分離的孢粉素很難進行化學降解，孢粉素的天然結構以及單體構成仍然沒有確定[9]。有證據(jù)表明早期陸生植物的小孢子壁(例如苔蘚植物石松)和被子植物的花粉壁的化學成分相似。因此，6億年前至4.5億年前的第一批陸生植物對地球環(huán)境的開拓使它們獲得了產(chǎn)生孢粉素多聚體來保護單倍體小孢子的能力。孢粉素可能是第一種開始進化的植物多聚酯類細胞外基質(zhì)[10]。

圖1 花粉壁的結構

3 絨氈層及其決定基因在花粉壁形成過程中的作用

3.1 絨氈層提供了花粉壁合成的原料

絨氈層位于花藥壁四層孢子體細胞的最內(nèi)層。早在20世紀60年代，Heslop-Harrison發(fā)現(xiàn)矮雪輪(Silene pendula)絨氈層細胞中的電子致密物質(zhì)聚集成斑塊狀，最終作為孢粉素原料運輸?shù)叫℃咦颖砻鎇11]。在百合中的觀察也發(fā)現(xiàn)脂類物質(zhì)在絨氈層中形成，逐漸轉(zhuǎn)移到細胞膜外聚合形成烏氏體作為花粉外壁的原料[12]。隨著分子生物學的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)絨氈層特異啟動子啟動的核糖核酸酶會導致轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出花粉完全敗育的性狀[13]，這個結果從分子水平上闡明了絨氈層對于花粉形成是不可或缺的一環(huán)。在擬南芥中，絨氈層從花藥原基的L2細胞層發(fā)育而來，到花藥發(fā)育第5期形成明顯的絨氈層結構[14]。在減數(shù)分裂期間，絨氈層細胞的細胞質(zhì)變得濃密，進行核內(nèi)有絲分裂，形成雙核的、缺少初生壁的極性分泌細胞[15]，其中充滿了核糖體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體等細胞器，顯示其代謝高度活躍。減數(shù)分裂完成后，小孢子外的胼胝質(zhì)壁在絨氈層分泌的胼胝質(zhì)酶作用下降解，小孢子從四分體中釋放出來并開始發(fā)育成熟?；ㄋ幗q氈層通過細胞內(nèi)切面釋放小孢子發(fā)育所需要的蛋白質(zhì)、脂類及其他營養(yǎng)物質(zhì)[16]。在花粉第一次有絲分裂完成時，絨氈層明顯開始降解，通過將自身的質(zhì)體轉(zhuǎn)化為造油體以及較大的細胞質(zhì)含油體。這些物質(zhì)在絨氈層降解后釋放到藥室內(nèi)，積累在成熟花粉的表面形成一層復雜的脂質(zhì)包被[5]。

3.2 絨氈層發(fā)育關鍵基因以及遺傳通路

目前發(fā)現(xiàn)有多個轉(zhuǎn)錄因子在絨氈層細胞形成后對其發(fā)育和功能起著重要的調(diào)控作用。DYT1編碼一個在花藥發(fā)育早期表達的 basic helix-loop-helix(bHLH)家族轉(zhuǎn)錄因子，控制著相當多的絨氈層特異基因的表達[17]；TDF1則編碼一個R2R3 MYB家族轉(zhuǎn)錄因子參與絨氈層的早期發(fā)育[18]；轉(zhuǎn)錄因子AMS也屬于bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子[19-20]。這些基因的突變體中絨氈層細胞能夠形成，但隨即出現(xiàn)異?？张莼⑶曳蚀螅蛩幨覂?nèi)部擠壓，導致小孢子提前降解。DYT1的表達高峰出現(xiàn)在花藥發(fā)育的第5期，表明DYT1在絨氈層細胞命運決定后首先發(fā)揮功能。TDF1的表達高峰則出現(xiàn)在DYT1之后(第6期)，而且定量RT-PCR和原位雜交實驗結果顯示該基因處于DYT1的下游。AMS基因的表達主要集中在第6期和第7期的絨氈層細胞中，定量RT-PCR和原位雜交實驗顯示其定位在TDF1的下游[21]。這表明三個早期表達的轉(zhuǎn)錄因子依次啟動來調(diào)控絨氈層的發(fā)育。在絨氈層后期的生物學功能研究中，MYB家族MYB103基因的表達在第7期的絨氈層中非常特異，該基因的突變導致花粉外壁外層不能形成，表明MYB103是調(diào)控花粉外壁外層合成的特征基因[22]。MS1則編碼一個具有PHD-finger結構域的轉(zhuǎn)錄因子，該基因在花藥第9期表達才到最高峰，與前幾個轉(zhuǎn)錄因子相差較遠。ms1突變體的絨氈層細胞直到在四分體釋放后的小孢子發(fā)育階段，才顯示出較為明顯的空泡化現(xiàn)象，其小孢子外壁結構異常但依然存在表明其功能可能受到了部分的影響，這些結果說明MS1的主要功能在于后期對絨氈層功能調(diào)節(jié)和細胞凋亡機制的啟動[23-24]。最近，本實驗室通過定量RT-PCR與原位雜交，以及雙突變體遺傳分析等方法表明這些轉(zhuǎn)錄因子在遺傳上存在著上下游的關系(DYT1-TDF1-AMS-MYB103-MS1)[21]。這條遺傳通路通過MYB103調(diào)控花粉外壁外層的形成。此外，在絨氈層的發(fā)育過程中，甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase)家族的兩個成員AtGPAT1及AtGPAT6參與調(diào)控甘油酯生物合成的第一步，這兩個基因的突變體中絨氈層細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)異常，絨氈層的分泌功能受到影響，導致半不育的表型[25-26]。

4 花粉外壁的形成依賴于孢粉素的合成與運輸

目前一些研究發(fā)現(xiàn)了一個可能存在的孢粉素代謝途徑：首先，在絨氈層質(zhì)體中形成的脂肪酸經(jīng)過脂肪酸乙酰輔酶 A合成酶(Acyl-CoA synthetase5)(ACOS5)的修飾后轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。ACOS5在花藥絨氈層特異表達，其產(chǎn)物對于油酸(C18:1)有較強特異性，而不是羥基肉桂酸，表示該蛋白并不是一個4-香豆酸輔酶A連接酶。這些結果表明ACOS5參與到花藥發(fā)育中與孢粉素合成相關的中鏈脂肪酸(C8到C16)的代謝過程。該基因的突變導致孢粉素合成途徑被抑制，小孢子外壁缺失導致花粉敗育[27]。隨后，這些輔酶A化的酯類被擬南芥的細胞色素P450酶CYP703A2進行內(nèi)羥化。CYP703A2的敲除突變體有部分雄性不育的表型，且缺少成熟的花粉外壁，這顯然是因為缺少孢粉素造成的[28]。CYP703A2專一地作用在可能為孢粉素前體的7-羥基月桂酸(C12)。其在苔蘚植物和陸生植物進化上的高度保守表明這個酶參與了一個很古老且保守的孢粉素合成的生化途徑[28]。同樣在擬南芥中，CYP704B1也催化了脂肪酸鏈的內(nèi)羥化，但其底物為質(zhì)體合成的 C16 及 C18脂肪酸，其突變體也有與cyp703a2相似的表型[29]。接著，這些羥基化的脂肪酸被脂肪酸還原酶male sterility 2(MS2)轉(zhuǎn)化為脂肪醇，由一個 ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ATP binding cassette transporter, ABCG26) 運送出絨氈層以后到達小孢子表面進行聚合[30-32]。同時，有證據(jù)表明在苯丙醇的代謝途徑中，有兩個花藥特異表達的編碼查爾酮合成酶的基因(LAP5、LAP6)參與孢粉素前體的合成，它們將長鏈脂肪酸酰基輔酶A加入苯環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)楸奖碱愇镔|(zhì)[33]。

5 初生外壁(primexine)在花粉外壁形成中的作用

花粉外壁的前體來源于絨氈層，花粉外壁的沉積模式則依賴于小孢子母細胞所產(chǎn)生的初生外壁。初生外壁位于小孢子質(zhì)膜與胼胝質(zhì)層之間。減數(shù)分裂期間，小孢子母細胞會在細胞膜外分泌由β-1,3-葡聚糖組成的胼胝質(zhì)層以取代原有的細胞壁。胼胝質(zhì)具有將小孢子與花藥孢子體細胞隔離、防止細胞融合以及防止小孢子過早發(fā)育等作用[34-35]。在擬南芥中，胼胝質(zhì)合成酶基因callose synthase5(CalS5)在小孢子母細胞中高效表達，對四分體胼胝質(zhì)層的合成起主要作用。在該基因的敲除突變體中，小孢子周圍的胼胝質(zhì)合成量降低，導致初生外壁形成缺陷，隨后的花粉外壁沉積也受到嚴重影響，這表明了胼胝質(zhì)層作為初生外壁形成的模板在隨后的花粉壁發(fā)育中有極其關鍵的作用[36-37]。

初生外壁的成分來源于小孢子，由多聚糖、纖維素以及一些蛋白組成[38], 其沉積模式?jīng)Q定了隨后花粉外壁的結構模式，是花粉外壁形成的藍圖[39]。初生外壁在減數(shù)分裂后的小孢子表面出現(xiàn)，位于胼胝質(zhì)層與質(zhì)膜之間。隨后小孢子質(zhì)膜開始產(chǎn)生明顯的波浪型，此時的初生外壁基質(zhì)緊靠著胼胝質(zhì)層。纖維性原料開始填充在初生外壁上，逐漸在質(zhì)膜的波浪型頂端形成棒狀前體。這些棒狀前體將決定花粉外壁的沉積模式[40-41]。因此，花粉外壁的形成不僅依賴于初生外壁，與小孢子質(zhì)膜也有關系。一種說法認為，波浪型的質(zhì)膜結構擴展了細胞周質(zhì)間隙，形成了初生外壁物質(zhì)積累的空間[42]，此種類型的質(zhì)膜中的細胞骨架、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和液泡可能與初生外壁的精確定位相關[43]。另一種說法則認為，初生外壁成分從小孢子釋放出來，對于小孢子質(zhì)膜表面的滲透壓產(chǎn)生影響，造成了細胞骨架的拉伸，從而導致質(zhì)膜的波浪型和初生外壁的間隔分布[44]。

目前在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了4個蛋白與初生外壁的形成相關。在defective in exine formation1 (dex1)和no exine formation1(nef1)突變體中，孢粉素前體雖然能由絨氈層正常分泌，但是單倍體小孢子表面初生外壁沉積被延遲，而且厚度也變薄。隨后的前柱狀體(probacula)不能形成，導致孢粉素無法正常積累在小孢子表面。伴隨外壁構建的缺陷，突變體的小孢子也進而降解。DEX1編碼一個具有鈣結合結構域的未知蛋白[45]，而NEF1基因編碼一個可能在絨氈層質(zhì)體內(nèi)膜定位的蛋白質(zhì)[1]。RUPTURED POLLEN GRAIN1(RPG1)編碼一個 MtN3/saliva家族蛋白，該家族蛋白通常是膜整合蛋白，并含有兩個拷貝的 MtN3/saliva結構域，該基因的突變體導致花粉壁結構產(chǎn)生明顯缺陷，沒有正?；ǚ鄣木W(wǎng)格狀結構，而只有點狀的脂類物質(zhì)分布。透射電鏡揭示rpg1突變體中花粉壁的早期決定出現(xiàn)問題，造成花粉壁構建時期孢粉素不能正確沉積在花粉表面從而導致花粉壁異常[2]。最近的研究表明，RPG1作為一個糖轉(zhuǎn)運蛋白來執(zhí)行生物學功能，這進一步表明了初生外壁的單體主要由糖類所聚合而成[46]。NO PRIMEXINE AND PLASMA MEMBRANE UNDULATION(NPU)基因編碼一個有兩個跨膜結構域的未知功能膜蛋白。該基因的缺失突變體表現(xiàn)為初生外壁的積累以及小孢子細胞膜的波浪型完全喪失。因此該突變體初生外壁的缺陷比以上三個突變體更為嚴重[47]。這些基因的克隆有助于花粉外壁發(fā)育模式的分子機理的深入研究。

6 花粉內(nèi)壁的合成過程由配子體控制

在小孢子釋放之后，由孢子體合成的花粉外壁沉積在初生壁上，在小孢子和雄配子發(fā)育時，由果膠構成的花粉內(nèi)壁在花粉內(nèi)合成[38]。近來有一些編碼和花粉內(nèi)壁形成有關的纖維素合成酶的基因(cellulose synthase)CESA被克隆，其中cesa1及cesa3的敲除突變體表現(xiàn)為配子體不育表型，并且可以看到花粉壁的形成都發(fā)生異常，此外功能冗余的CESA2、CESA6及CESA9基因的三突變體也有相似的表型[48]。此外，擬南芥中AtUSP是一個編碼 UDP-sugar焦磷酸化酶的基因，突變體表型為外壁正常，而敗育的小孢子內(nèi)壁特異缺失，其突變體同樣表現(xiàn)出配子體敗育表型，這些結果表明花粉內(nèi)壁合成確實由小孢子自身調(diào)控[49]。

以上這些花粉成熟過程障礙或花粉壁形成缺陷的擬南芥雄性不育突變體幫助我們闡明了花粉壁模式形成，孢粉素生物合成與積累過程中的細胞生物學及生化機制。

7 結語

植物花粉外壁的形成是一個復雜的生物學過程，依賴于小孢子自身和花藥絨氈層的共同作用，其過程嚴格地受到許多基因的調(diào)控。這些基因通過在不同時空上的特異表達實現(xiàn)對胼胝質(zhì)及初生外壁的合成、孢粉素合成、運輸和沉積等一系列重要生命過程的精確控制，從而控制花粉壁的形成。盡管這些基因的功能已經(jīng)得到了一定的了解，但各個基因在遺傳和生化水平的上下游關系尚不清楚。因此，對已知基因進一步系統(tǒng)的研究以及挖掘新的參與花粉壁發(fā)育的調(diào)控位點將使這些獨立分散的知識系統(tǒng)化，以便能更好地闡明花粉壁發(fā)育的分子機理。

(2012年12月3日收稿)

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