徐慶宣，陳 健，黃曉芳，陳 浩，葉 敏，石志琦

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650000;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所，江蘇 南京 210014)

側(cè)根是植物根系的重要組成部分，對(duì)養(yǎng)分吸收、錨定植株以及植株抗病方面起關(guān)鍵作用。側(cè)根的生長(zhǎng)發(fā)育是遺傳因子和外部生物及非生物因素共同刺激作用的結(jié)果。許多外界環(huán)境因素如光照、溫度、二氧化碳、水分、營(yíng)養(yǎng)元素、外源植物激素等都可影響到側(cè)根的生長(zhǎng)［1-3］。丁香酚(Eugenol，4-烯丙基-2-甲氧基苯酚)是植物丁香揮發(fā)油的主要成分，具有抗氧化、殺菌消炎、解熱、麻醉、防腐、驅(qū)蚊等效果。陳浩等研究發(fā)現(xiàn)丁香酚對(duì)西葫蘆病毒病具有較好的防治效果，可以有效緩解染病植株葉片皺縮、矮化等癥狀［4］;蘇杭等研究結(jié)果表明丁香酚通過誘導(dǎo)煙草植株系統(tǒng)獲得抗性抗煙草花葉病毒病，并可以提高煙草植株葉綠素含量，說明丁香酚可通過調(diào)控植株生長(zhǎng)抵抗病原菌侵染［5-7］。對(duì)于植物提取物促進(jìn)側(cè)根發(fā)生活性已有報(bào)道［8］，進(jìn)一步研究丁香酚促進(jìn)植物側(cè)根的發(fā)育機(jī)理將有助于明確丁香酚對(duì)植物生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用。

硫化氫(H2S)是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后發(fā)現(xiàn)的植物體內(nèi)第三種氣體信號(hào)分子。最近的研究結(jié)果表明，H2S參與調(diào)控植物多種生理過程，如氣孔運(yùn)動(dòng)、不定根發(fā)育、增強(qiáng)光合作用、緩解干旱、滲透和金屬離子等多種非生物脅迫造成的傷害，且 Ca2+可作為 H2S下游信號(hào)發(fā)揮作用［9-12］。丁香酚是否并怎樣通過H2S調(diào)控植物側(cè)根發(fā)育值得深入研究。

本試驗(yàn)以番茄為供試植株，研究丁香酚和H2S供體NaHS對(duì)番茄幼苗側(cè)根發(fā)生的影響，以及H2S清除劑對(duì)丁香酚和NaHS調(diào)控側(cè)根發(fā)生過程的影響。同時(shí)，根據(jù)根尖細(xì)胞內(nèi)Ca2+的響應(yīng)情況，研究丁香酚調(diào)控側(cè)根生長(zhǎng)可能的信號(hào)響應(yīng)途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

番茄品種蘇紅2003，購(gòu)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院種子店;H2S供體硫氫化鈉 (NaHS)、H2S清除劑亞?；撬?(Hypotaurine，HT)均購(gòu)自 Sigma公司;Ca2+熒光染料Flour-3 AM購(gòu)于海門碧云天生物科技有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。智能光照培養(yǎng)箱由寧波江南儀器廠生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物培養(yǎng) 選取飽滿的番茄種子經(jīng)5.0%次氯酸鈉(NaClO)消毒15 min后，用蒸餾水沖洗3～4次，于25℃黑暗中催芽，待根長(zhǎng)為2～3 cm時(shí)挑選生長(zhǎng)一致的番茄幼苗轉(zhuǎn)移培養(yǎng)槽光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光周期為14 h，溫度為25℃，每隔24 h更換1次Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配方為NH4H2PO428.700 μmol/L，Ca(NO)2164.100 μmol/L，KNO3151.650 μmol/L，MgSO460.190 μmol/L，H3BO30.710 μmol/L，CuSO40.020 μmol/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.330 μmol/L，MnSO4·H2O 0.604 μmol/L，MoO30.004 μmol/L，ZnSO40.055 μmol/L，各種鹽類單獨(dú)配置1000倍貯備液，用時(shí)稀釋，最后pH值調(diào)整到5.5。

1.2.2 番茄側(cè)根數(shù)目的統(tǒng)計(jì) 挑選根長(zhǎng)一致且尚未長(zhǎng)出側(cè)根的番茄幼苗轉(zhuǎn)移到Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中。(1)首先設(shè)定處理液濃度:丁香酚［0 μmol/L(對(duì)照)、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、35 μmol/L、60 μmol/L、120 μmol/L］，NaHS ［0 μmol/L(對(duì)照)、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L］，統(tǒng)計(jì)番茄幼苗側(cè)根數(shù);(2)根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選取促進(jìn)番茄側(cè)根生長(zhǎng)效果最好的處理液(丁香酚和NaHS)分別處理番茄幼苗，每隔24 h統(tǒng)計(jì)番茄幼苗側(cè)根數(shù);(3)根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選取促進(jìn)番茄側(cè)根生長(zhǎng)效果最好的處理液(丁香酚和NaHS)分別添加H2S清除劑200 μmol/L HT后處理番茄幼苗，統(tǒng)計(jì)番茄幼苗側(cè)根數(shù)。以上每個(gè)處理各30株苗，并設(shè)有3個(gè)重復(fù)，結(jié)果用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 Ca2+熒光檢測(cè) 將番茄根部切下，迅速吸干表面水分，然后浸入Flou-3 AM探針液內(nèi)，避光放置30 min后，用蒸餾水沖洗根部，吸干表面水分，在熒光電子顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 丁香酚和硫氫化鈉(NaHS)對(duì)番茄側(cè)根生長(zhǎng)的影響

將番茄幼苗轉(zhuǎn)移到不同濃度的丁香酚和NaHS處理液中，培育5 d后，發(fā)現(xiàn)丁香酚和NaHS促進(jìn)番茄側(cè)根生長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯的濃度效應(yīng)。隨著丁香酚濃度的升高，番茄幼苗側(cè)根數(shù)目呈先增加后減少趨勢(shì)。當(dāng)丁香酚濃度為5～35 μmol/L時(shí)，番茄幼苗平均側(cè)根數(shù)目顯著高于對(duì)照(P＜0.05);其中30 μmol/L丁香酚處理下的番茄幼苗平均側(cè)根數(shù)目最多，比對(duì)照高出60%左右。隨著丁香酚濃度的繼續(xù)升高(60 μmol/L和120 μmol/L)，番茄幼苗平均側(cè)根數(shù)目與對(duì)照間差異不顯著。NaHS作為H2S供體，可以給植株提供外源H2S。隨著NaHS濃度的升高，番茄幼苗側(cè)根數(shù)目呈先增加后減少趨勢(shì)。當(dāng)NaHS濃度為10～40 μmol/L時(shí)，番茄幼苗平均側(cè)根數(shù)目顯著高于對(duì)照(P＜0.05);其中15 μmol/L NaHS處理下的番茄幼苗平均側(cè)根數(shù)目最多，為對(duì)照的2倍。隨著NaHS濃度的繼續(xù)升高(80 μmol/L)，番茄幼苗平均側(cè)根數(shù)目與對(duì)照間差異不顯著(圖1)。

選取30 μmol/L丁香酚和 15 μmol/L NaHS 分別處理番茄幼苗，每隔24 h統(tǒng)計(jì)其側(cè)根數(shù)目。結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)30 μmol/L丁香酚處理的番茄幼苗平均側(cè)根數(shù)目隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而增加，且不同處理時(shí)間下番茄幼苗平均側(cè)根數(shù)目均顯著高于對(duì)照(P＜0.05)。表明，丁香酚對(duì)番茄側(cè)根發(fā)生的影響有明顯的濃度和時(shí)間效應(yīng)。同樣，15 μmol/L NaHS處理下番茄幼苗平均側(cè)根數(shù)目隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而增加，且不同處理時(shí)間下番茄幼苗平均側(cè)根數(shù)目均顯著高于對(duì)照(P＜0.05)。

圖1 不同濃度丁香酚和硫氫化鈉處理對(duì)番茄幼苗側(cè)根生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effects of different concentrations of eugenol and NaHS on the growth of tomato lateral root

圖2 30 μmol/L丁香酚和15 μmol/L NaHS處理對(duì)番茄幼苗側(cè)根生長(zhǎng)的時(shí)間效應(yīng)Fig.2 The time-dependent effect of 30 μmol/L eugenol and 15 μmol/L NaHS on the growth of tomato lateral root

2.2 H2S清除劑亞?；撬?HT)對(duì)丁香酚和硫氫化鈉調(diào)控番茄幼苗側(cè)根生長(zhǎng)的影響

為了進(jìn)一步研究丁香酚與H2S信號(hào)的關(guān)系在促進(jìn)番茄幼苗側(cè)根生長(zhǎng)過程中的作用，我們檢測(cè)了H2S清除劑HT對(duì)丁香酚和NaHS促進(jìn)番茄幼苗側(cè)根生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，30 μmol/L丁香酚和15 μmol/LNaHS處理下番茄幼苗側(cè)根數(shù)目均顯著高于對(duì)照、30 μmol/L 丁 香 酚 +200 μmol/L HT、15 μmol/LNaHS+200 μmol/L和 200 μmol/L HT 處理(P＜0.05)。這說明H2S清除劑HT能夠減弱丁香酚和NaHS促進(jìn)番茄幼苗側(cè)根生長(zhǎng)的效應(yīng)，表明H2S可能作為下游信號(hào)介導(dǎo)了丁香酚對(duì)側(cè)根生長(zhǎng)的促進(jìn)效應(yīng) (圖3)。

圖3 H2S清除劑亞?；撬?HT)對(duì)丁香酚和NaHS促進(jìn)側(cè)根生長(zhǎng)的影響Fig.3 The effect of H2S scavenger HT on eugenol-and NaHS-promoted growth of tomato lateral root

2.3 丁香酚和硫氫化鈉(NaHS)處理對(duì)番茄幼苗根內(nèi)源Ca2+的影響

Ca2+原位熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，番茄側(cè)根從側(cè)根原基發(fā)生到側(cè)根形成過程中都有Ca2+積累(圖4)，說明Ca2+對(duì)于番茄幼苗側(cè)根的發(fā)生必不可少。進(jìn)一步的研究結(jié)果(圖5)顯示，丁香酚 (30 μmol/L)和NaHS(15 μmol/L)處理均能促進(jìn)番茄根內(nèi)Ca2+積累，而加入H2S清除劑HT后，顯著抑制了丁香酚促進(jìn)Ca2+積累的效應(yīng)。這說明，在丁香酚促進(jìn)側(cè)根發(fā)育的過程中，Ca2+可能作為H2S的下游信號(hào)發(fā)揮作用。

圖4 番茄側(cè)根發(fā)育過程中內(nèi)源Ca2+積累的熒光染色顯示Fig.4 Fluorescent staining of endogenous Ca2+during the development of tomato lateral root

3 討論

圖5 不同處理下番茄根細(xì)胞內(nèi)Ca2+積累的熒光染色顯示Fig.5 Fluorescent staining of Ca2+in tomato root with different treatments

近年來，植物生根劑作為農(nóng)藥中的一大重要類群，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)、林、園藝等生產(chǎn)中，發(fā)揮了重要的作用。植物是天然化合物的寶庫(kù)，因此，從植物中尋找促生根活性物質(zhì)，對(duì)開發(fā)新型高效、安全、與環(huán)境友好的生根劑具有重要意義［13］。了解天然化合物調(diào)控植株根發(fā)生機(jī)理，對(duì)開發(fā)和應(yīng)用植物源生根劑有很好的指導(dǎo)意義。而目前，丁香酚研究主要集中于抗病性研究，關(guān)于其促側(cè)根活性，國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示30 μmol/L丁香酚處理的番茄幼苗平均側(cè)根數(shù)高出對(duì)照60%，具有很好的促側(cè)根活性。后續(xù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丁香酚促側(cè)根活性可以被H2S清除劑HT抑制，由此推測(cè)丁香酚調(diào)控番茄側(cè)根發(fā)生與H2S信號(hào)相關(guān)。Lin等研究結(jié)果表明，H2S供體NaHS可以誘導(dǎo)黃瓜幼苗不定根的產(chǎn)生［14］;Zhang等發(fā)現(xiàn)H2S可以促進(jìn)切根甘薯、旱柳和大豆幼苗不定根的發(fā)生［15］，由此可以看出，H2S信號(hào)響應(yīng)在植物側(cè)根發(fā)育過程中普遍存在，而且可以通過NaHS添加外源H2S信號(hào)調(diào)控植株的側(cè)根發(fā)育活性;而低濃度的NaHS可以促進(jìn)番茄側(cè)根的發(fā)生，因此，可以初步確定丁香酚通過H2S信號(hào)途徑調(diào)控番茄側(cè)根的生長(zhǎng)。

Ca2+作為植物細(xì)胞內(nèi)的第二信使，參與眾多生理過程。細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度的變化是行使其信使功能的基礎(chǔ)。有文獻(xiàn)報(bào)道Ca2+對(duì)擬南芥、水稻、萵苣幼苗有促進(jìn)側(cè)根形成的作用，通過NaHS預(yù)處理煙草、蠶豆細(xì)胞可以致使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度大幅度上升，發(fā)揮生理調(diào)控作用［16-19］。本研究結(jié)果也顯示番茄側(cè)根發(fā)生過程與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度密切相關(guān)，而丁香酚和NaHS都可以通過顯著提高根尖細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平促進(jìn)側(cè)根發(fā)生，并且這種作用可以被H2S清除劑HT抑制。由此我們可以推斷丁香酚作用番茄幼苗根細(xì)胞，介導(dǎo)了根細(xì)胞內(nèi)H2S信號(hào)途徑，從而導(dǎo)致細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流或胞內(nèi)Ca2+庫(kù)中Ca2+的釋放，使胞內(nèi)Ca2+水平升高，Ca2+進(jìn)一步激活下游信號(hào)，誘導(dǎo)了側(cè)根發(fā)生。

本研究初步闡明了丁香酚促進(jìn)側(cè)根發(fā)生的部分機(jī)理，同時(shí)也為H2S參與植物側(cè)根發(fā)育提供了新的理論證據(jù)，但關(guān)于丁香酚如何調(diào)控H2S信號(hào)以及H2S與Ca2+信號(hào)的互作還有待進(jìn)一步研究。

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