雞IGFBP-3基因多態(tài)性及其與生產(chǎn)性能的相關(guān)性

金崇富， 葛兆建， 楊智青， 時 凱， 陳長寬， 陳應(yīng)江

(江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 鹽城 224002)

胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP-3)主要存在于血液中，它對IGF-I和IGF-II具有很高的親和力，是血液中最為豐富的IGFBP結(jié)合形式。血液中95%的IGF-I和IGF-II都與IGFBP-3結(jié)合，因此，IGFBP-3對于 IGF作用的發(fā)揮起著重要作用［1］。IGFBP-3屬于超家族中的高親和力類型，基因定位于2p12214，mRNA長2.4 kb，多肽鏈由264個氨基酸(含18個Cys)組成，分子量約29 000，一級結(jié)構(gòu)中存在3個N2型糖基化位點和肝素結(jié)合位點，在Ser位點上可以被磷酸化，其氨基酸序列中還存在入核定位序列(NLS)。目前有關(guān)IGFBP-3基因多態(tài)性的研究主要集中在牛［2］、羊［3-4］和豬［5］上，有關(guān)雞IGFBP-3基因的多態(tài)性研究鮮有報道，僅檢索到金崇富等［6］和俞亞波等［7］的報道。本研究擬利用PCR-SSCP、PCR-RFLP及DNA測序技術(shù)，對IGFBP-3基因多態(tài)性進行研究，以期為雞繁殖、生長發(fā)育性狀的遺傳標(biāo)記研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

200只母雞血樣采自江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生態(tài)養(yǎng)殖基地，同時記錄其生長性狀(初生重，4、8、12、16 周齡體質(zhì)量)及繁殖性狀(開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體質(zhì)量、開產(chǎn)蛋質(zhì)量、300日齡產(chǎn)蛋數(shù))。翅靜脈采集血樣1.5 ml，肝素鈉抗凝，－20℃保存。常規(guī)苯酚-氯仿法抽提基因組DNA，對基因組DNA進行OD值測定，計錄濃度后備用。

1.2 引物設(shè)計及PCR擴增

根據(jù)雞的IGFBP-3基因序列(GenBank登錄號為NC_006089)設(shè)計IGFBP-3基因8個外顯子的測序用引物P1～P10，用于直接測序。引物由上海生工生物工程有限公司合成。由于第4外顯子較長，序列比較特殊，沒能設(shè)計出合適的引物，故本試驗沒有對第4外顯子進行研究。10對引物的詳細(xì)信息見表1。

表1 引物信息Table 1 The information of primers used in this study

1.3 DNA 池構(gòu)建

在稀釋好的200份DNA樣品中，每份取5 μl混合在同一管內(nèi)，作為池DNA，用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)的搜索［8］。

1.4 PCR 擴增

IGFBP-3基因引物最佳PCR擴增體系:DNA 1.0 μl，10 × Buffer 2.0 μl，Mg2+(25 mmol/L)2.2 μl，上下游引物(10 pmol/μl)各 1.0 μl，dNTPs(10 mmol/L)0.8 μl，Taq DNA 聚合酶(2 U/L)0.2 μl，ddH2O 11.8 μl，總體系 20.0 μl。

IGFBP-3基因引物PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性6 min;95℃變性30 s，退火(溫度見表1)30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán);72℃延伸10 min，10℃保存。

1.5 PCR-SSCP 分析

將2.5 μl PCR產(chǎn)物加入7.5 μl的變性緩沖液中，98℃變性10 min，然后迅速冰浴5 min。將變性好的PCR產(chǎn)物點樣加入到10%的聚丙烯酰胺凝膠中，250 V電壓預(yù)電泳10 min后在140 V電壓下電泳8～24 h。電泳結(jié)束后銀染顯色并拍照。

1.6 PCR-RFLP 分析

MspⅠ 酶切反應(yīng)體系:PCR擴增產(chǎn)物10.0 μl，限制性內(nèi)切酶 Msp Ⅰ 0.4 μl，10 × Buffer 2.0 μl，ddH2O 7.6 μl，總體系20.0 μl，37 ℃酶切過夜，酶切產(chǎn)物用10%的聚丙烯酰胺電泳分析，電泳結(jié)束后銀染顯色并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)分析

配合下列模型進行最小二乘方差分析，比較雞IGFBP-3各基因型之間的差異(對各引物的基因型單獨分析):yij=μ+Gi+eij，其中:yij為性狀測定值;μ為群體平均值;Gi為基因型效應(yīng);eij為隨機殘差效應(yīng)。

所有統(tǒng)計分析均采用SPSS統(tǒng)計軟件的GLM(General linear model)過程完成，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 DNA測序結(jié)果

以DNA為模板，用引物P1～P8擴增的產(chǎn)物直接測序，結(jié)果表明，在第160 bp(引物P1擴增結(jié)果)和1 087 bp(引物P2-1擴增結(jié)果)處出現(xiàn)雙峰，表明在這2個位置發(fā)生突變(圖1)，分別記為T160G位點和C1087T位點。其中在第160 bp處突變位于第1外顯子和第1內(nèi)含子連接部分，屬于內(nèi)含子突變。

圖1 PCR產(chǎn)物直接序列結(jié)果Fig.1 The sequencing results of PCR products

2.2 酶切位點的發(fā)現(xiàn)

通過已知突變利用Primer premier 5軟件的Enzyme功能尋找酶切位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C1087T位點的多態(tài)性導(dǎo)致了MspⅠ酶切位點的突變(圖1)。

2.3 PCR-RFLP 結(jié)果

IGFBP-3基因第2外顯子1 087 bp處(C1087T位點)的C→T的突變，產(chǎn)生了MspⅠ酶切位點(C↓CGG)多態(tài)性，經(jīng)酶切消化后產(chǎn)生大小分別為161、161/95/66、95/66的3種帶型(圖2)，分別命名為CC、CT、TT 基因型。

2.4 PCR-SSCP 結(jié)果

P1引物擴增片段采用PCR-SSCP分析，結(jié)果表明，P1擴增片段有3種帶型，定義為AA、AB和BB(圖3)。

圖2 IGFBP-3基因第2外顯子P2-1引物的PCR產(chǎn)物MspⅠ酶切結(jié)果Fig.2 Identification of PCR products of exon 2 in IGFBP-3 gene by MspⅠdigestion

圖3 引物P1的SSCP分析結(jié)果Fig.3 SSCP analysis of primer P1 by PCR

2.5 序列分析結(jié)果

PCR產(chǎn)物片段測序結(jié)果表明，BB型與AA型相比在160 bp處發(fā)生了T→G突變(圖4);TT型與CC型相比在1 087 bp處發(fā)生了C→T突變(圖 5)。

圖4 P1引物擴增產(chǎn)物AA與BB型的序列比較Fig.4 Sequence alignment of genotypes AA and BB in chickens using primer P1

圖5 P2-1引物擴增產(chǎn)物CC與TT型的序列比較Fig.5 Sequence alignment of genotypes CC and TT in chickens using primer P2-1

2.6 IGFBP-3基因與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)分析

2.6.1 IGFBP-3基因T160G位點與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析 T160G位點不同基因型對京海黃雞母雞生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)分析見表2。AA、AB、BB 3種基因型在開產(chǎn)體質(zhì)量、開產(chǎn)蛋質(zhì)量、300日齡產(chǎn)蛋數(shù)、4周齡體質(zhì)量12周齡體質(zhì)量16周齡體質(zhì)量方面均無顯著差異(P＞0.05)，AB基因型開產(chǎn)日齡顯著低于AA基因型(P＜0.05)，初生重顯著高于BB基因型(P＜0.05)，8周齡體重顯著高于AA基因型(P＜0.05)。

2.6.2 IGFBP-3基因C1087T位點與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析 C1087T位點不同基因型對母雞生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)分析見表3。CC、CT、TT 3種基因型在開產(chǎn)體質(zhì)量、開產(chǎn)蛋質(zhì)量、300日齡產(chǎn)蛋數(shù)、初生質(zhì)量以及4、8、12、16周齡體質(zhì)量方面均無顯著差異(P＞0.05)。僅CT基因型開產(chǎn)日齡顯著低于TT基因型(P ＜0.05)。

3 討論

3.1 內(nèi)含子突變的影響

內(nèi)含子在原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工過程中被切除，不包含在成熟mRNA的序列中，在每個外顯子和內(nèi)含子的接頭區(qū)，有一段高度保守的共有序列，即每個內(nèi)含子的5'端起始的兩個核苷酸都是GT，3'端末尾的兩個核苷酸都是AG，這是RNA剪接的信號，這種接頭形式稱為GT-AG法則［9］。近年來人們對內(nèi)含子的功能提出許多新的見解，其中最重要的一個方面是內(nèi)含子在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用［9］。目前在許多基因的內(nèi)含子中均發(fā)現(xiàn)了基因表達(dá)的調(diào)控元件，其中大多為增強元件，通常認(rèn)為基因的第1個內(nèi)含子對其表達(dá)具有重要的調(diào)控作用。基因的編碼區(qū)突變以及內(nèi)含子與外顯子交界處的突變可能導(dǎo)致基因的結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生變化［10］。

表2 T160G位點基因型與生產(chǎn)性能的相關(guān)性Table 2 Association of genotypes with production performance based on T160G site

表3 C1087位點基因型與生產(chǎn)性能的相關(guān)性Table 3 Association of genotypes with production performance based on C1087 site

本試驗在IGFBP-3基因的外顯子1和內(nèi)含子1結(jié)合處發(fā)現(xiàn)了1個SNP位點，即內(nèi)含子1的5'端起始的第2個核苷酸T突變?yōu)镚，打破了 GT-AG法則，從而影響了RNA剪接的信號，可能導(dǎo)致IGFBP-3基因的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，進而對IGFBP-3基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，最終影響雞的生產(chǎn)性能。

3.2 IGFBP-3基因的多態(tài)性及其與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)分析

1997年，Maciulla等［11］利用 PCR-RFLP方法首次報道IGFBP-3基因的651片段的HaeⅢ酶切多態(tài)性，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，第299 bp處的C→A的顛換(GGCC→GGAC)導(dǎo)致一個HaeⅢ限制性酶切位點的丟失而產(chǎn)生了HaeⅢ酶切多態(tài)性。張永宏等［12］以草原紅牛為研究對象，采用PCR-SSCP方法檢測IGFBP-3基因的多態(tài)性，并將不同基因型與部分屠宰性狀進行相關(guān)分析，結(jié)果在第2內(nèi)含子處發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點，該位點的多態(tài)性對草原紅牛的眼肌面積有顯著影響(P＜0.05)。沈敏等［13］采用PCR-SSCP方法對中國美利奴羊和哈薩克羊中IGFBP-3基因的多態(tài)性進行了檢測，并對不同基因型與中國美利奴羊部分羊毛性狀間的關(guān)聯(lián)性進行了分析，結(jié)果表明，不同基因型對部分羊毛性狀有一定影響。李美玉等［14］利用PCR-RFLP技術(shù)對7個山羊群體的501個個體進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn):該位點與斷奶山羊質(zhì)量和眼肌面積顯著相關(guān)(P＜0.05)，與3月齡體長和胸圍極顯著相關(guān)(P＜0.01)，與10月齡體長、胸圍和12月齡體長顯著相關(guān)(P＜0.05)。張潤峰等［15］以IGFBP-3基因作為中國荷斯坦牛部分泌乳性狀的候選基因，對中國荷斯坦牛群體中IGFBP-3基因座多態(tài)性與泌乳性狀進行相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGFBP-3基因座與產(chǎn)奶量、乳蛋白率和體細(xì)胞評分顯著相關(guān)(P＜0.05)。高雪等［16］采用PCR-SSCP技術(shù)分析了牛類胰島素生長因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP-3)基因在南陽牛、魯西牛和中國西門塔爾牛3個牛品種中的遺傳多態(tài)性，結(jié)果表明:第2外顯子在第8 069 bp處發(fā)生單堿基突變T→C，并導(dǎo)致苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼帷?/p>

本試驗對雞IGFBP-3基因2個SNPs位點與繁殖性狀(開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體質(zhì)量、開產(chǎn)蛋質(zhì)量和300日齡產(chǎn)蛋數(shù))進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示:T160G位點AB基因型開產(chǎn)日齡顯著低于AA基因型(P＜0.05);C1087位點CT基因型開產(chǎn)日齡顯著低于TT基因型(P＜0.05)。初步推測IGFBP-3基因T160G和C1087可作為雞早期產(chǎn)蛋性狀的一個候選分子標(biāo)記，用于標(biāo)記輔助選擇。

對雞IGFBP-3基因2個SNPs位點與生長性狀(初生質(zhì)量、4、8、12、16 周齡體質(zhì)量)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示:T160G位點AB基因型初生重顯著高于BB基因型(P＜0.05)，8周齡體質(zhì)量顯著高于AA基因型(P＜0.05)，AB基因型為體質(zhì)量的優(yōu)勢基因型，但AB基因型為雜合子，交配后會發(fā)生基因分離的現(xiàn)象，不能固定，生產(chǎn)中難以利用該位點來提高雞的體質(zhì)量。C1087位點對雞的生長性狀沒有顯著影響。

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