趙 喆，唐素芳（天津市藥品檢驗所，天津 300070）

地奧司明臨床上用于治療與靜脈、淋巴功能不全相關的各種疾?。ㄈ珈o脈性水腫、軟組織腫脹、四肢沉重等）及急性痔發(fā)作，其制劑主要有地奧司明片。目前，地奧司明原料藥及制劑尚未載入2010年版《中國藥典》，而執(zhí)行的標準是國家食品藥品監(jiān)督管理局暫行標準（國標）[1]。現(xiàn)版的國外藥典中如《歐洲藥典》（EP7.0）[2]和《英國藥典》（BP）2012年版[3]僅收載地奧司明的原料藥，均未收載制劑。根據(jù)國家藥典委員會2011年基本藥物標準提高的任務分工，我所對該品種質(zhì)量標準進行了修訂，對質(zhì)量標準中性狀、鑒別、檢查和含量測定等項目均進行了試驗研究，并結(jié)合樣品的檢驗情況，擬訂了質(zhì)量標準。其中有關物質(zhì)的研究工作參考了EP7.0有關物質(zhì)的檢查方法并結(jié)合國內(nèi)產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝等實際情況，對本品的雜質(zhì)情況進行了研究和考察，建立了有效可控的有關物質(zhì)檢查方法，并采用同一色譜系統(tǒng)對含量進行了測定，完善了質(zhì)量標準，有效控制了本品的質(zhì)量，本文對此報道如下。

1 材料

1200系列高效液相色譜（HPLC）儀，包括泵、脫氣機、二極管陣列檢測器、自動進樣設備、柱溫箱等（美國Agilent公司）；AE 240型分析天平（瑞士Mettler Toledo儀器公司）。

地奧司明對照品（某藥廠提供，批號：120501，純度：98.1%）；橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110721-201115，純度：95.3%）；地奧司明系統(tǒng)性試驗對照品（購自歐洲藥品質(zhì)量管理局，為包含地奧司明和6種雜質(zhì)的混合對照品）；地奧司明原料藥（四川某公司，批號：C006G110301、C006G110601、C006G110602；江蘇某公司，批號：100908、100909、100910；純度：均＞90%）；地奧司明片（江蘇某公司，批號：120606、120607、120608；武漢某公司，批號：110207、110302、110303，規(guī)格：均為每片0.45g）；乙腈、甲醇均為色譜純，水為純化水。

2 有關物質(zhì)測定

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18（100mm×4.6mm，3μm）；流動相：水-甲醇-冰醋酸-乙腈（66∶28∶6∶2，V/V/V/V），流速：0.7ml/min；檢測波長：275nm；柱溫：40℃；進樣量：10μl。

2.2 溶液的制備

系統(tǒng)適用性溶液：稱取系統(tǒng)適用性對照品5mg，加二甲基亞砜（DMSO）5ml溶解，即得。

橙皮苷對照品貯備液：精密稱取橙皮苷對照品10mg，置于10ml量瓶中，加DMSO溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液a（有關物質(zhì)）：精密稱取原料藥（或片粉）適量，加DMSO溶解并制成1mg/ml的溶液，搖勻（片劑溶液過濾，取續(xù)濾液），即得。

對照溶液（有關物質(zhì)）：精密量取橙皮苷對照品貯備液1ml和供試品溶液a 3ml，置于100ml量瓶中，加DMSO稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液b（含量測定）：精密稱取原料（或片粉）適量，加DMSO溶解并制成0.2mg/ml的溶液，搖勻（片劑溶液過濾，取續(xù)濾液），即得。

輔料溶液：按照江蘇某公司提供的處方比例，按供試品溶液b配制方法配制不含主成分的輔料溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

量取系統(tǒng)適用性溶液10μl注入色譜儀，考察分離效果。結(jié)果顯示，系統(tǒng)適用性溶液中的6個雜質(zhì)（A、B、C、D、E、F）全部檢出并達到基線分離，橙皮苷峰與主峰的分離度為8.0，理論板數(shù)按主峰計為3700，詳見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖1.雜質(zhì)A；2.雜質(zhì)B（橙皮苷）；3.雜質(zhì)C；4.地奧司明；5.雜質(zhì)D；6.雜質(zhì)E；7.雜質(zhì)F；8.溶劑Fig 1 HPLC chromatogram of system suitability test1.impurity A；2.impurity B（hesperidin）；3.impurity C；4.diosmin；5.impurity D；6.impurity E；7.impurity F；8.solvent

系統(tǒng)適用性對照品目前國內(nèi)無法提供，只能購自歐洲藥品質(zhì)量管理局，且價格昂貴，而中國食品藥品檢定研究院僅能夠提供橙皮苷對照品。為適應國內(nèi)的檢驗條件，本次試驗選擇了3根不同品牌的色譜柱Phenomenex、Inertsil ODS-3、Waters Atlantis T3[分別編號①、②、③，規(guī)格均為（100mm×4.6mm，3μm）]，分別取系統(tǒng)適用性溶液進樣考察，擬通過限定橙皮苷峰與主峰的分離度作為系統(tǒng)適用性試驗的條件，確保所有雜質(zhì)的分離和檢出，結(jié)果分離度分別為8.0、5.3、4.6，理論板數(shù)分別為3700、7000、6500。表明系統(tǒng)適用性溶液中的6個雜質(zhì)如能全部檢出并達到基線分離，橙皮苷峰與主峰的分離度應至少＞4.6。不同色譜柱的理論板數(shù)差異較大，結(jié)合試驗數(shù)據(jù)將理論板數(shù)定為不低于3000。根據(jù)試驗結(jié)果，擬定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗為“2.1”項下色譜條件，量取對照溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，橙皮苷峰與主峰的分離度應不低于4.6，理論板數(shù)按主峰計算應不低于3000。

2.4 有關物質(zhì)的測定方法及限度的確定

量取對照溶液適量，用DMSO稀釋20倍作為靈敏度測試溶液，注入色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主峰的信噪比不小于10；再精密量取供試品溶液a與對照溶液分別注入色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的5倍。雜質(zhì)的限度和計算方法經(jīng)參考EP7.0中地奧司明的雜質(zhì)限度，并結(jié)合收集到的樣品有關物質(zhì)的測定結(jié)果，修訂為：已知雜質(zhì)橙皮苷按外標法計算，限度不得過5.0%；其他單個雜質(zhì)按主成分自身對照法計算，含量在1.0%～3.0%的雜質(zhì)不得多于3個，剩余的其他單個雜質(zhì)不得過1.0%?？傠s質(zhì)（含橙皮苷）按主成分自身對照法計算，原料藥限度不得過10.0%；片劑考慮其生產(chǎn)及貯存過程中雜質(zhì)可能增加的情況，并結(jié)合收集到的樣品的有關物質(zhì)的測定結(jié)果，修訂為“不得過13.0%”。

2.5 專屬性試驗

分別取地奧司明原料藥（批號：C006G110301）25mg、片粉（批號：120606）40mg和輔料10mg各4份，分別加DMSO 15ml進行如下處理。（1）酸破壞：加1mol/L的鹽酸溶液4ml，80℃水浴加熱10min，放冷，用氫氧化鈉試液調(diào)至pH為7，加DMSO稀釋至25ml（片粉和輔料溶液需過濾，以下同）。（2）堿破壞：加氫氧化鈉試液1ml，放置2h，用1mol/L鹽酸溶液調(diào)至pH為7，加DMSO稀釋至25ml。（3）氧化破壞：加30%過氧化氫溶液1ml，80℃水浴加熱30min，放冷，加DMSO稀釋至25ml。（4）高溫破壞：80℃水浴加熱30min，放冷，加DMSO稀釋至刻度，搖勻。（5）光照破壞：加DMSO稀釋至刻度，搖勻，直接光照5d。分別取上述5種溶液，進樣測定，結(jié)果表明在上述條件下，除高溫和光照條件下溶液比較穩(wěn)定，色譜圖基本無變化外，其余條件下主峰均有降解，但降解的雜質(zhì)均可與主峰達到基線分離。說明擬定的色譜條件專屬性較好，輔料溶液基本無變化，對測定無干擾，詳見圖2。

圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖A.酸破壞樣品；B.堿破壞樣品；C.氧化破壞樣品；D.高溫破壞樣品；E.光照破壞樣品；F.輔料；1.地奧司明Fig 2 HPLC chromatograms of specificity testA.samples destroyed by acid；B.samples destroyed by alkali；C.samples destroyed by oxidant；D.samples destroyed by high temperature；E.samples destroyed by strong light；F.excipients；1.diosmin

2.6 線性關系試驗

精密稱取橙皮苷和地奧司明對照品適量，用DMSO稀釋制成二者質(zhì)量濃度均為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0μg/ml的系列溶液，分別注入色譜儀，記錄色譜圖；分別以橙皮苷和地奧司明的質(zhì)量濃度（c）為橫坐標，以相應的峰面積（A）為縱坐標，進行線性回歸。結(jié)果，橙皮苷線性方程為A＝1.99×10c－1.404（r＝0.9999，n＝7）（相應的雜質(zhì)限度范圍為0.1%～10.0%），檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.996～99.7μg/ml；地奧司明線性方程為A＝1.64×10c－12.449（r＝0.9999，n＝6）（相應的雜質(zhì)限度范圍為0.25%～10.0%），線性范圍為2.47～98.9μg/ml。

2.7 檢測限確定

取“2.6”項下溶液適量，采用逐步稀釋法稀釋，進樣測定，結(jié)果信噪比為3時，地奧司明、橙皮苷的檢測限分別為15、5ng。

2.8 系統(tǒng)精密度試驗

取對照溶液和供試品a溶液（批號：C006G110301）適量，分別重復進樣6次，對照溶液中橙皮苷、地奧司明峰面積RSD分別為0.4%、0.5%，供試品溶液a中地奧司明峰面積RSD為0.2%，表明本系統(tǒng)精密度良好。

2.9 方法精密度試驗

按照“2.2”項下方法配制6份供試品（批號：C006G110301）溶液進樣測定，計算，結(jié)果基本一致，詳見表1。

表1 有關物質(zhì)精密度試驗結(jié)果Tab 1 Results of precision test of related substances

2.10 穩(wěn)定性試驗

取對照溶液及供試品溶液a適量在室溫下分別放置0、4、8、12、24h，測定。結(jié)果對照溶液中橙皮苷峰面積的RSD為0.5%，供試品溶液中地奧司明、橙皮苷峰面積的RSD分別為0.5%、2.6%。表明溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.11 橙皮苷加樣回收率試驗

分別精密稱取地奧司明原料藥（批號：C006G110301）7份（其中1份作為空白），每份100mg，置于100ml量瓶中，加DMSO適量，使溶解，精密加入橙皮苷對照品貯備液1ml，加DMSO稀釋至刻度，搖勻，注入色譜儀，記錄色譜圖；空白溶液同法測定橙皮苷，扣除峰面積后計算回收率。結(jié)果平均回收率為98.8%，RSD為1.1%（n＝6）。

2.12 耐用性試驗

本次試驗采用3種不同型號的色譜柱，對不同廠家的同一批樣品進行耐用性考察，按“2.3”項下色譜柱編號進行試驗，結(jié)果基本一致，詳見表2。

表2 耐用性試驗結(jié)果（n＝3）Tab 2Results of durability test（n＝3）

上述結(jié)果顯示，采用不同的色譜柱測定，檢出雜質(zhì)個數(shù)基本相同，最大單一雜質(zhì)和總雜質(zhì)量的測定結(jié)果基本一致，橙皮苷的測定結(jié)果也基本一致。表明本方法的耐用性較好，不同型號的C18色譜柱均適用。

2.13 有關物質(zhì)測定結(jié)果

精密量取對照溶液與供試品溶液a，按照“2.4”項下方法，對6批原料藥和6批片劑進行有關物質(zhì)測定，結(jié)果見表3、圖3。

表3 樣品測定結(jié)果（n＝2）Tab 3Results of content determination of samples（n＝2）

圖3 樣品測定高效液相色譜圖A.對照溶液；B.供試品溶液a；C.供試品溶液b；1.橙皮苷；2.地奧司明；3.溶劑Fig 3 HPLC chromatograms of samplesA.control solution；B.test solution a；C.test solution b；1.hesperidin；2.diosmin；3.solvent

3 主成分含量測定

采用有關物質(zhì)項下的色譜系統(tǒng)，供試品溶液的質(zhì)量濃度修訂為0.2mg/ml。經(jīng)試驗，地奧司明線性方程為A＝1.62×10c－1.05×10（r＝0.9999，n＝5），檢測質(zhì)量濃度線性范圍為99.63～298.9μg/ml，平均回收率為 99.2%（RSD＝0.5%，n＝6）。按照擬定方法測定6批原料藥和6批片劑中主成分的含量，結(jié)果見表3、圖3。

4 討論

4.1 色譜系統(tǒng)的選擇

前期試驗中采用國家標準中色譜系統(tǒng)對系統(tǒng)適用性溶液進行試驗，結(jié)果其中的6個雜質(zhì)（A、B、C、D、E、F）在該色譜系統(tǒng)中未能全部檢出，而在EP7.0的色譜系統(tǒng)中能全部被檢出，表明EP7.0的流動相系統(tǒng)優(yōu)于現(xiàn)有國家標準。

4.2 色譜柱的選擇（5μm和3μm色譜柱的選擇）

本文建立的方法采用色譜柱為C18（100mm×4.6mm，3μm），規(guī)格較特殊，在日常檢驗工作中不常使用。因此，對可否用常規(guī)的色譜柱替代，筆者做了如下比對試驗：選用了3根不同品牌的常規(guī)C18（250mm×4.6mm，5μm），用系統(tǒng)適用性溶液分別進樣，考察分離效果。結(jié)果顯示，5μm色譜柱中，只有1根（Phenomenex）色譜柱能全部檢出6個雜質(zhì)，但雜質(zhì)B與雜質(zhì)C未達到基線分離，且雜質(zhì)的相對保留時間與EP7.0中標注的完全不同，其他2根色譜柱均不能完全分出6個雜質(zhì)；而不同品牌的3μm內(nèi)徑的色譜柱能將6個雜質(zhì)全部分離出來，且雜質(zhì)的相對保留時間與EP7.0基本相同。表明內(nèi)徑3μm色譜柱的分離效果明顯優(yōu)于5μm的色譜柱，更有利于雜質(zhì)的全部檢出。故擬定標準中規(guī)定選用特殊規(guī)格的色譜柱。

綜上所述，本文的色譜系統(tǒng)能完全有效地檢出并分離地奧司明原料藥及片劑的有關物質(zhì)，可有效地控制本品的質(zhì)量，優(yōu)于國家現(xiàn)行質(zhì)量標準。

[1] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.YBH01832009地奧司明[S].2009-02-10.

[2] Directorate for the Quality of Medicines&Healthcare of the Council of Europe（EDQM）.European Pharmacopoeia[S].7.0.Strasbourg ：Council of Europe，2010：1864-1865.

[3] British Pharmacopoeia Commission.British Pharmacopoeia[S].2012edition.London：Stationary Office，2011：729-730.