應(yīng)曉蘭 葛力瑜 郝海濱 楊超波 曾文君 申屠楊萍 袁琳波

（1.溫州醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)學(xué)院機(jī)能中心，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)學(xué)院生理教研室，浙江 溫州 325035）

鐵是人體最豐富和必要的微量元素，體內(nèi)的鐵按其功能可分為必需與非必需兩種。必需鐵占體內(nèi)鐵總量的70%，存在于血紅蛋白、肌紅蛋白、血紅素酶類、輔助因子和運(yùn)輸鐵中；非必需鐵則作為體內(nèi)的儲(chǔ)備鐵，主要以鐵蛋白和含鐵血黃素的形式存在于肝、脾和骨髓等器官組織中。鐵由于其獨(dú)特的化學(xué)反應(yīng)活性，在維持細(xì)胞和機(jī)體正常代謝過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，如氧的輸送、線粒體的氧化反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)和DNA 合成等［1-3］。

Hepcidin為最近發(fā)現(xiàn)的一種富含半胱氨酸的抗菌多肽。已有研究通過(guò)基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠的研究得到其調(diào)控機(jī)體鐵代謝平衡的直接證據(jù)［4］。由此，學(xué)者們認(rèn)為hepcidin很可能就是長(zhǎng)期以來(lái)人們一直在尋找的存在于小腸、肝臟、骨髓和巨噬細(xì)胞之間的可溶性信號(hào)物質(zhì)。它可能通過(guò)調(diào)節(jié)DMT1、Fpn1等鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，抑制十二指腸對(duì)鐵的吸收及巨噬細(xì)胞鐵的釋放［5］。目前，國(guó)內(nèi)外均罕見(jiàn)hepecidin信號(hào)對(duì)腦衰老作用機(jī)制的報(bào)道。本研究旨在探討脈絡(luò)叢hepcidin與腦鐵代謝和腦衰老之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑

右旋糖酐鐵注射液（河南省海天藥業(yè)有限公司，批號(hào)：010708），轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin，Tf）和總鐵結(jié)合力（Total ironbinding capacity，TIBC）測(cè)定試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒（南京建成生物技術(shù)研究所）。

1.2 動(dòng)物及分組

63只5-6周齡體重為16-20g的清潔級(jí)昆明小鼠，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK （滬）2003-0003）。小鼠按體重隨機(jī)分為7 組，每組9 只。將右旋糖酐鐵注射液配成3 個(gè)濃度梯度：2 mg·ml-1、1 mg·ml-1、0.5mg·ml-1；空白對(duì)照組隔日大腿肌肉注射0.1 ml生理鹽水，鐵負(fù)荷組隔日大腿肌肉注射不同濃度的右旋糖酐鐵注射液0.1ml，hepcidin組先側(cè)腦室注射5μg hepcidin，再注射不同濃度的右旋糖酐鐵注射液0.1ml，連續(xù)8w，各組動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)室溫度21-25℃，相對(duì)濕度40-60%。

1.3 血液指標(biāo)測(cè)定

采用鼠尾刺血法分別在鐵負(fù)荷的第2、4、6和8w取血，血液在cell-Dyn1700型血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上測(cè)定血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）含量；血清鐵（Fe）含量采用AU2700全自動(dòng)生化儀測(cè)定；血清轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin，Tf）含量和總鐵結(jié)合力（Total iron-binding capacity，TIBC）的測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 腦組織中鐵及ROS含量測(cè)定

鐵負(fù)荷及hepcidin 注射8w 后，各組小鼠進(jìn)行水合氯醛麻醉，并迅速斷頭取腦，分離大腦皮層、小腦、海馬、紋狀體、中腦和腦干，分別稱重后于-80℃保存?zhèn)溆?。取上述組織分別以60℃硝酸（按1∶10稀釋）消化48～72h，取100μl消化后組織加2%硝酸1 ml，采用原子吸收光譜法（Atomic absorption spectrophotometry，AAS）測(cè)各部分腦組織中鐵的含量。ROS含量檢測(cè)嚴(yán)格按照ROS試劑盒進(jìn)行。

1.5 Morris水迷宮

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，保持迷宮外參照物、室內(nèi)亮度和實(shí)驗(yàn)者所處位置固定不變，保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)安靜。（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前將小鼠置于站臺(tái)上適應(yīng)20s，然后將小鼠隨機(jī)從不同象限面壁置入池內(nèi)，小鼠登上站臺(tái)5s后終止記錄，最長(zhǎng)記錄時(shí)間為60s。若小鼠在60s內(nèi)不能上臺(tái)，引導(dǎo)其登上站臺(tái)適應(yīng)10s，最后將小鼠擦干放入鼠籠。如此將小鼠置入游泳池，3次為1組，定位航行訓(xùn)練需要完成5組，計(jì)平均值。分別測(cè)量6組小鼠平均逃逸時(shí)間，以評(píng)價(jià)小鼠的空間學(xué)習(xí)能力，分別在鐵負(fù)荷的第2、4、6和8周重復(fù)上述步驟。（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：定位航行1d后撤除水面下的站臺(tái)，然后將小鼠隨機(jī)從不同象限內(nèi)壁置入水池5次，每次記錄小鼠在60s內(nèi)的游泳軌跡并進(jìn)行分析；同時(shí)分別測(cè)量小鼠在靶象限內(nèi)的活動(dòng)時(shí)間，以評(píng)判大鼠的空間記憶能力。在第2、4、6和8周重復(fù)上述步驟。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用表示，采用SPSS14.0軟件進(jìn)行分析，水迷宮數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)雙因素方差分析，其余數(shù)據(jù)間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同組小鼠血液Hb、血清Fe、Tf含量、TIBC含量測(cè)定

與對(duì)照組比較，鐵負(fù)荷小鼠血紅蛋白量、血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白含量升高，且呈時(shí)間和劑量依賴性（P＜0.05），而血清Tf含量和TIBC降低（P＜0.05）。Hepcidin組血紅蛋白量、血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白含量較鐵負(fù)荷組降低，血清Tf含量和TIBC較鐵負(fù)荷組升高，見(jiàn)表1。

2.2 腦組織中鐵含量

8周末，取小鼠右側(cè)半球大腦、小腦、中腦、腦干、海馬和紋狀體組織，并行鐵含量測(cè)定，結(jié)果顯示，小腦、中腦、海馬和紋狀體中鐵含量明顯增加，而hepcidin 明顯抑制鐵的表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3 腦組織ROS含量

ROS含量檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，鐵負(fù)荷小鼠腦組織ROS含量增加（P＜0.05），Hepcidin組較鐵負(fù)荷組有明顯抑制作用，且呈時(shí)間和劑量依賴性，見(jiàn)表2。

2.4 Morris水迷宮

定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2mg鐵負(fù)荷第8w 小鼠平均逃逸時(shí)間較空白對(duì)照組明顯增加（P＜0.01）；空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2mg鐵負(fù)荷8w 小鼠靶象限活動(dòng)時(shí)間較空白對(duì)照組明顯增加，Hepcidin組較鐵負(fù)荷組時(shí)間明顯縮短，見(jiàn)表3。

表1 第8周小鼠血液中Hb、血清Fe、Tf、TIBC含量（ ）

表1 第8周小鼠血液中Hb、血清Fe、Tf、TIBC含量（ ）

注：與對(duì)照組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與鐵負(fù)荷組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

表2 第8周小鼠腦組織中鐵和ROS含量（ ）

表2 第8周小鼠腦組織中鐵和ROS含量（ ）

注：與對(duì)照組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與鐵負(fù)荷組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3 討論

鐵過(guò)負(fù)荷病因可分為遺傳學(xué)和獲得性的兩類。主要的遺傳性疾病是遺傳性血色病，還有難治性貧血，如重型海洋性貧血，遺傳性鐵粒幼細(xì)胞性貧血。獲得性疾病見(jiàn)于一些難治性貧血，再障需輸血（可致鐵過(guò)負(fù)荷），長(zhǎng)期攝入鐵劑。隨著鐵攝入或輸血增多，過(guò)量的鐵最終超過(guò)含鐵血黃素沉著癥的范圍，造成組織明顯損害。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)肌注鐵劑形成不同鐵負(fù)荷動(dòng)物模型，通過(guò)血清鐵、血紅蛋白、腦鐵等指標(biāo)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小腦，中腦和紋狀體中鐵和他主要的儲(chǔ)存形式鐵蛋白含量過(guò)度，同時(shí)由本實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)，鐵過(guò)負(fù)荷加速記憶力下降，空間定位能力下降等。因此推測(cè)鐵過(guò)負(fù)荷對(duì)小鼠小腦，中腦和紋狀體造成明顯毒性損害。

表3 第8周小鼠運(yùn)動(dòng)能力比較（ ）

表3 第8周小鼠運(yùn)動(dòng)能力比較（ ）

注：與對(duì)照組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與鐵負(fù)荷組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

通過(guò)對(duì)鐵負(fù)荷小鼠腦組織ROS水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ROS含量增加，且呈時(shí)間和劑量依賴性。ROS可通過(guò)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死。機(jī)體內(nèi)的自由基通過(guò)其濃度調(diào)節(jié)著機(jī)體細(xì)胞的生死平衡。由此我們推測(cè)，鐵通過(guò)影響氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生作用［6］。

Hepcidin可調(diào)節(jié)小腸鐵代謝過(guò)程，但hepcidin信號(hào)分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有無(wú)表達(dá)？在腦的哪些區(qū)域有表達(dá)？如有表達(dá)，其具體的作用途徑和作用機(jī)制又是如何？這些問(wèn)題目前尚不清楚。在前期實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，hepcidin信號(hào)分子在腦的廣泛區(qū)域（包括大腦皮質(zhì)、海馬、間腦、小腦、中腦、腦橋和紋狀體）也有高度表達(dá)，而且隨著動(dòng)物年齡的增加，大腦皮質(zhì)、紋狀體和海馬hepcidin mRNA 表達(dá)顯著增加［7-8］。通過(guò)提取大鼠脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞總mRNA 發(fā)現(xiàn)，hepcidin mRNA 表達(dá)也很高。Hepcidin在腦的廣泛區(qū)域有表達(dá)，說(shuō)明其對(duì)腦鐵代謝是有調(diào)控作用的，但hepcidin調(diào)控腦鐵代謝的具體作用途徑和作用機(jī)制如何？在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用側(cè)腦室注射hepcidin預(yù)處理后進(jìn)行鐵負(fù)荷，發(fā)現(xiàn)可大大減少腦鐵的沉積和減緩運(yùn)動(dòng)能力的遲緩現(xiàn)象，證明hepcidin可調(diào)控腦鐵代謝，在某種程度上可延緩腦衰老。這些問(wèn)題的解決將為腦鐵代謝和腦衰老治療的研究打開(kāi)一個(gè)新的廣闊的領(lǐng)域。今后的研究中我們將從細(xì)胞水平進(jìn)一步研究hepcidin調(diào)控的神經(jīng)細(xì)胞鐵代謝過(guò)程及其機(jī)制。

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