不同質(zhì)量濃度脫落酸對小白菜硫代葡萄糖苷含量的影響

胡克玲，朱祝軍

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，安徽 合肥 230036;2 浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300)

硫代葡萄糖苷簡稱硫苷，是一種主要分布于十字花科植物中的富含氮硫的次生代謝產(chǎn)物，與人類的身體健康有非常密切的關(guān)系，在抗癌方面的作用已得到人們的公認(rèn)［1］.根據(jù)側(cè)鏈基團的氨基酸來源不同，可將硫苷分為脂肪族、芳香族、吲哚族硫苷［2］.硫苷合成除了受到硫、鹽［3］等因素影響外，也受一些植物生長激素的調(diào)控［4］.隨著對植物激素生理功能和作用機制方面研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)植物激素和硫苷存在著非常復(fù)雜的相互作用［4］.

脫落酸(Absicsic acid，ABA)作為植物體內(nèi)一種重要的植物激素，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、衰老以及適應(yīng)環(huán)境脅迫方面具有重要的作用［5］.但目前，有關(guān)外源ABA 影響植物硫苷含量的報道較少，外源ABA 對植株硫苷含量的影響機制尚不清楚.為了探索ABA對硫苷的調(diào)控機制，本文研究了不同濃度的外源ABA 對小白菜硫苷含量和組成的影響，探討不同濃度ABA 處理對小白菜硫苷含量和組成的影響機制，以期為硫苷的合成調(diào)控提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與試驗設(shè)計

選用小白菜Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.)Makino var.communis Tsen et Lee‘上海青'為試驗材料.將小白菜種子播種于蛭石中，待其生長至2～3 片真葉時，挑選生長一致的幼苗，移栽到10 L的塑料箱中，溶液培養(yǎng).營養(yǎng)液成分:Ca (NO3)2、KH2PO4、KNO3、MgSO4和NH4NO3濃度分別為2.5、1.0、4.0、1.0 和0.5 mmol·L-1，H3BO3、H2MoO4、MnSO4、ZnSO4、CuSO4和EDTA-Fe 濃度分別為10.0、0.1、3.0、2.0、0.8 和40.0 μmol·L-1.培養(yǎng)期間每3～4 天更換1 次營養(yǎng)液.白天溫度25～30℃，夜間溫度15～18℃，最大光照強度為3 萬lx.

試驗設(shè)置5 、10 和20 mg·L-1的ABA 3 個處理，以清水為對照(CK).先將ABA(Sigma 公司產(chǎn)品)配制成1 000 mg·L-1的溶液，再根據(jù)試驗所需進行稀釋.將ABA 溶液均勻噴施于小白菜葉面，每株一次性噴施5 mL.每個處理重復(fù)3 次，每個重復(fù)為6 株，每處理共18 株.處理7 d 后取樣.整株采收，用濕棉布包裹小白菜根部，放進泡沫箱中，迅速運回實驗室.將地上部與根部分割，測定地上部鮮質(zhì)量，并用液氮迅速處理，保存在超低溫冰箱(-80℃)中，然后在冷凍干燥機中干燥，研磨，在超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2 硫苷含量分析

參照Krumbein 等［6］、陳新娟等［7］的方法并略微修改.稱取0.25 g 凍干樣品于80℃水浴中預(yù)熱1 min 后，用4 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇于75℃水浴條件下提取10 min，冷卻后加入1 mL 乙酸鋇，用漩渦儀充分混合后，4 000 r·min-1離心10 min，保存上清液，沉淀再用體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇提取2 次.將3 次提取的上清液定容至10 mL.同時做1 個平行重復(fù)，在另一份樣品中加入5 mmol·L-1的2-丙烯基硫苷(Sigma-Aldrich Co.，MO，USA)100 μL 作為內(nèi)標(biāo)，其他操作相同.取5 mL 提取液在0.03 MPa 壓力下流經(jīng)DEAE SephadexTMA25 (Amersham Biosciences，Sweden)固相萃取柱，待提取液全部流出小柱后，加入200 μL 硫酸酯酶液(Sigma-Aldrich Co.，MO，USA).室溫反應(yīng)12 h 后用5 mL 超純水洗脫.洗脫液用0.45 μm 濾膜過濾后在4℃條件下保存，待高效液相色譜(HPLC)分析.

HPLC 分離條件:色譜柱為Prontosil ODS2(250×4 mm，5 μm;Bischoff，Germany).柱溫30℃.流動相為超純水和乙腈.梯度條件為0～45 min 內(nèi)乙腈濃度線性梯度變化0～20%，水梯度變化為100%～80%.檢測波長229 nm，流速1.3 mL·min-1.

1.3 統(tǒng)計分析

作圖采用Originlab 7.5 軟件.數(shù)據(jù)采用SAS 軟件進行方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 ABA 處理對小白菜生長的影響

如圖1 所示，在本試驗所設(shè)置質(zhì)量濃度下，小白菜的地上部鮮質(zhì)量隨ABA 處理質(zhì)量濃度的增加有下降的趨勢，但與對照相比并沒有顯著的差異.

圖1 不同質(zhì)量濃度ABA 處理對小白菜地上部鮮質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of ABA with different concentrations on fresh mass of pakchoi shoots

2.2 ABA 處理對小白菜地上部脂肪族硫苷含量的影響

在小白菜地上部共檢測到7 種單個硫苷，分別是:3 種脂肪族硫苷，包括5-甲基亞磺酰戊基硫苷(Glucoalyssin)，3-丁烯基硫苷(Gluconapin)，4-戊烯基硫苷(Glucobrassicanapin);3 種吲哚族硫苷，包括吲哚-3-甲基硫苷(Glucobrasscin)，4-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷(4-methoxyglucobrasscin)，1-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷(Neoglucobrassicin);1 種芳香族硫苷，即2-苯乙基硫苷(Gluconasturtin).

不同質(zhì)量濃度ABA 處理對單個脂肪族硫苷和總脂肪族硫苷含量均產(chǎn)生了不同程度的影響.在ABA 處理下，5-甲基亞磺酰戊基硫苷(圖2A)含量與對照差異不顯著.不同質(zhì)量濃度ABA 處理下，3-丁烯基硫苷(圖2B)和總脂肪族硫苷(圖2D)含量呈相似的變化趨勢.較低質(zhì)量濃度ABA(5 mg·L-1)處理對3-丁烯基硫苷和總脂肪族硫苷含量沒有顯著影響;但隨著ABA 質(zhì)量濃度的增加，兩者含量有下降的趨勢，特別是在ABA 質(zhì)量濃度為10 mg·L-1時，兩者含量最低，與對照相比，分別減少了38%和42%.不同質(zhì)量濃度ABA 處理均降低了4-戊烯基硫苷(圖2C)含量，尤其在ABA 質(zhì)量濃度為10 mg·L-1時顯著降低了4-戊烯基硫苷含量，比對照降低了56%.說明ABA 對脂肪族硫苷合成為負(fù)調(diào)控.

圖2 不同質(zhì)量濃度ABA 處理對小白菜地上部(干品)脂肪族硫苷含量的影響Fig.2 Effects of ABA with different concentrations on contents aliphatic glucosinolates

2.3 ABA 處理對小白菜地上部吲哚族硫苷含量的影響

與對照相比，ABA 質(zhì)量濃度增加對吲哚-3-甲基硫苷含量沒有顯著的影響(圖3A).在低質(zhì)量濃度ABA(5 mg·L-1)處理時4-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷含量無顯著變化，但隨ABA 質(zhì)量濃度增加，4-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷含量呈遞減趨勢(圖3B).1-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷含量隨ABA 質(zhì)量濃度的增加有先升高后下降的趨勢，10 mg·L-1處理時達(dá)到最高值，比對照增加62%(圖3C).總吲哚族硫苷含量隨ABA 質(zhì)量濃度增加，也呈先升后降的趨勢，在ABA 質(zhì)量濃度為10 mg·L-1時其含量達(dá)到最高，但在低質(zhì)量濃度(5 mg·L-1)與較高質(zhì)量濃度(10 mg·L-1)處理之間沒有顯著差異(圖3D).可見，ABA 處理對多數(shù)吲哚族硫苷含量有一定的濃度效應(yīng).

2.4 ABA 處理對小白菜地上部芳香族硫苷含量的影響

如圖4 所示，與對照相比，5 和10 mg·L-1ABA處理對芳香族硫苷/2-苯乙基硫苷含量沒有顯著影響.但較高質(zhì)量濃度(20 mg·L-1)ABA 處理能夠顯著誘導(dǎo)2-苯乙基硫苷的合成，其含量比對照增加了143%.

2.5 ABA 處理對小白菜地上部總硫苷含量的影響

從圖5 可知，與對照相比，在較低質(zhì)量濃度(5 mg·L-1)ABA 處理下，總硫苷含量沒有顯著的變化.但隨著ABA 質(zhì)量濃度的增加，總硫苷含量顯著降低，尤其在10 mg·L-1的ABA 處理下，總硫苷含量達(dá)到最低值，比對照減少30%.說明在試驗所設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，ABA 處理并不能提高小白菜總硫苷含量，在較高濃度下反而降低了總硫苷含量.

圖3 不同質(zhì)量濃度ABA 處理對小白菜地上部(干品)吲哚族硫苷含量的影響Fig.3 Effects of ABA with different concentrations on indole glucosinolate content in pakchoi shoots

圖4 不同質(zhì)量濃度ABA 處理對小白菜地上部(干品)芳香族硫苷/2-苯乙基硫苷含量的影響Fig.4 Effects of ABA with different concentrations on the content of aromatic/gluconasturtin glucosinolates

圖5 不同質(zhì)量濃度ABA 處理對小白菜地上部(干品)總硫苷含量的影響Fig.5 Effects of ABA with different concentrations on total glucosinolate content in pakchoi shoots

2.6 ABA 處理對小白菜地上部3 類硫苷相對百分含量的影響

總脂肪族硫苷、吲哚族硫苷和芳香族硫苷占總硫苷比例如圖6 所示.ABA 處理對總脂肪族硫苷相對百分含量影響不大，僅10 mg·L-1的ABA 使其降低了11%.不同質(zhì)量濃度ABA 處理下，總吲哚族硫苷相對百分含量呈先增后降趨勢，在10 mg·L-1時吲哚族硫苷的相對百分含量達(dá)到最高，比對照增加109%，這可能與此時脂肪族硫苷相對百分含量減少有關(guān).在5 mg·L-1的ABA 處理時，芳香族硫苷相對百分含量所占比例有所下降，但隨ABA 質(zhì)量濃度的增加又顯著提高，在20 mg·L-1的ABA 處理時，比對照增加195%.

2.7 ABA 處理對小白菜地上部單個硫苷相對百分含量的影響

不同質(zhì)量濃度ABA 處理對小白菜7 種單個硫苷占總硫苷比例的影響見表1.較低質(zhì)量濃度(5 mg·L-1)ABA 處理時，5-甲基亞磺酰戊基硫苷相對百分含量并沒有明顯的變化，但較高質(zhì)量濃度(10 和20 mg·L-1)ABA 處理時，5-甲基亞磺酰戊基硫苷相對百分含量顯著增加.3-丁烯基硫苷是小白菜地上部最主要的硫苷，不同濃度ABA 處理下其相對百分含量沒有顯著變化.然而，4-戊烯基硫苷相對百分含量有下降的趨勢，尤其在5 mg·L-1的ABA 處理時顯著降低了4-戊烯基硫苷相對百分含量，與對照相比減少了37%.

圖6 不同質(zhì)量濃度ABA 處理對總脂肪族、總吲哚族和芳香族硫苷相對百分含量的影響Fig.6 Effects of ABA with different concentrations on the composition of glucosinolates

隨ABA 處理濃度的增加，吲哚-3-甲基硫苷相對百分含量呈先增加后降低趨勢，尤其在10 mg·L-1的ABA 處理時比對照增加57%.4-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷相對百分含量在10 mg·L-1ABA 處理時達(dá)到最大值，與對照相比增加38%.然而隨著ABA處理濃度增加，其相對百分含量迅速降低并低于對照水平.在不同濃度ABA 處理下，1-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷相對百分含量變化趨勢與4-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷相似，在10 mg·L-1的ABA 處理時達(dá)到最大值，與對照相比增加了153%，然后迅速降低至與對照水平相當(dāng).在5 mg·L-1的ABA 處理時，2-苯乙基硫苷相對百分含量與對照相比降低了42%，但隨著ABA 處理濃度增加，2-苯乙基硫苷相對百分含量又迅速升高，并在20 mg·L-1的ABA 處理時達(dá)到最大值，比對照增加近2 倍.

表1 不同質(zhì)量濃度ABA 處理對小白菜地上部單個硫苷相對總硫苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響1)Tab.1 Effects of ABA treatments on the percentages of individual glucosinolates against total glucosinolate in pakchoi shoots%

3 討論與結(jié)論

Moller 等［8］在油菜Brassica campestris 小孢子培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，外源添加ABA 對烯基脂肪族硫苷含量沒有顯著影響.在本試驗中發(fā)現(xiàn)，較低質(zhì)量濃度(5 mg·L-1)ABA 處理顯著降低了4-戊烯基硫苷含量，但對小白菜中另一種烯基硫苷3-丁烯基硫苷含量沒有影響.然而，隨著ABA 質(zhì)量濃度的增加，脂肪族硫苷含量除了5-甲基亞磺?；旎蜍找酝舛汲尸F(xiàn)下降趨勢.由于脂肪族硫苷是小白菜地上部最主要的硫苷，而且下降程度較大，使總硫苷含量有下降的趨勢.

較低質(zhì)量濃度(5 mg·L-1)ABA 處理只顯著提高了1-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷和總吲哚族硫苷含量.而隨ABA 質(zhì)量濃度增加，4-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷含量隨ABA 質(zhì)量增加呈現(xiàn)下降趨勢，1-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷含量和總吲哚族硫苷含量都呈先增加后降低的趨勢.Moller 等［8］發(fā)現(xiàn)供應(yīng)15 μmol·L-1的ABA 減少了吲哚族硫苷含量.然而，Bodnaryk［9］報道外源ABA 對植株吲哚族硫苷含量沒有影響.這可能是由于試驗作物的不同，但也說明了ABA 對吲哚族硫苷誘導(dǎo)作用具有濃度效應(yīng).

脫落酸與茉莉酸在結(jié)構(gòu)上有相似之處，在生理效應(yīng)上也有許多相似的地方，如促進氣孔關(guān)閉、葉片脫落等［4］.研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸能顯著誘導(dǎo)吲哚族硫苷的合成［10］.另外，Doughty 等［4］報道用不同濃度茉莉酸甲酯處理油菜，顯著誘導(dǎo)了吲哚族硫苷的累積，并且對1-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷含量的影響比對吲哚-3-甲基硫苷含量的影響更明顯.與此結(jié)果類似，本試驗也發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度ABA 處理提高了吲哚族硫苷的含量.10 mg·L-1的ABA 處理使總吲哚族硫苷和1-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷含量顯著提高，對吲哚-3-甲基硫苷含量則沒有顯著影響.而ABA 處理對單個吲哚族硫苷具有的這種選擇性累積效應(yīng)類似于機械傷害或油菜藍(lán)跳甲Altica cyanea 的噬咬［11-12］.這些信號物質(zhì)選擇性誘導(dǎo)單個吲哚硫苷的累積，也說明了這些硫苷具有不同的調(diào)控途徑.

2-苯乙基硫苷的水解產(chǎn)物是苯乙基異硫腈酸酯，被認(rèn)為具有降低致癌物質(zhì)活性的作用.外源水楊酸處理油菜，顯著誘導(dǎo)了2-苯乙基硫苷的合成［13］.Smetanska 等［14］在蕪菁Brassica rapa 中報道外源供應(yīng)水楊酸和茉莉酸均顯著誘導(dǎo)了2-苯乙基硫苷含量的提高.這是由于水楊酸和茉莉酸誘導(dǎo)了控制2-苯乙基硫苷合成基因CYP79A2 的表達(dá)［10］.本試驗中，20 mg·L-1的ABA 處理顯著誘導(dǎo)了2-苯乙基硫苷的合成.ABA 在植物防御反應(yīng)中可能是獨立的信號分子，也可能通過與水楊酸、茉莉酸和乙烯所調(diào)控的生物脅迫信號傳導(dǎo)途徑互作，共同調(diào)控植物的防御信號［15］.

ABA 對植物防御的調(diào)控較復(fù)雜，既有正向調(diào)控，也有負(fù)向調(diào)控，對小白菜3 類硫苷有不同的調(diào)控作用.ABA 對小白菜脂肪族硫苷含量為負(fù)調(diào)控作用，但對吲哚族硫苷和芳香族硫苷含量具有正向調(diào)控的作用，并具有一定的濃度效應(yīng).

［1］VERHOEVEN D T，VERHAGEN H，GOLDBOHM R A，et al.A review of mechanisms underlying anticarcinogenicity by brassica vegetables［J］.Chem-biol interact，1997，103(2):79-129.

［2］HALKIER B A，GERSHENZON J.Biology and biochemistry of glucosinolates［J］.Annu Rev Plant Biol，2006，57:303-333.

［3］HU Keling，ZHU Zhujun，ZANG Yunxiang，et al.Accumulation of glucosinolates and nutrients in pakchoi (Brassica campestris L.ssp.chinensis var.communis)two cultivar plants exposed to sulfur deficiency［J］.Hortic，Environ Biotechnol，2011，52(2):121-127.

［4］DOUGHTY K J，KIDDLE G A，PYE B J，et al.Selective induction of glucosinolates in oilseed rape leaves with methyl jasmonate［J］.Phytochemistry，1995，38(2):347-350.

［5］FUJITA M，F(xiàn)UJITA Y，NOUTOSHI Y，et al.Crosstalk between abiotic and biotic stress responses:A current view from the points of convergence in the stress signaling networks［J］.Curr Opin Plant Biol，2006，9(4):436-442.

［6］KRUMBEIN A，SCHONHOF I，SCHREINER M.Composition and contents of phytochemicals(glucosinolates，carotenoids and chlorophylls)and ascorbic acid in selected Brassica species(B.juncea，B.rapa subsp.nipposinica var.chinoleifera，B.rapa subsp.chinensis and B.rapa subsp.rapa)［J］.J Appl Bot Food Qual，2005，79(3):168-174.

［7］陳新娟，朱祝軍，錢瓊秋，等.硫苷的提取、分離和鑒定［J］.中國食品學(xué)報，2007，7(3):43-48.

［8］MOLLER S C，NEHLIN L，GLIMELIUS K，et al.Influence of in vitro culture conditions on glucosinolate composition of microspore-derived embryos of Brassica napus［J］.Physiol Plantarum，1999，107(4):441-446.

［9］BODNARYK R P.Potent effect of jasmonates on indole glucosinolates in oilseed rape and mustard［J］.Phytochemistry，1994，35(2):301-305.

［10］MIKKELSEN M D，PETERSEN B L，GLAWISCHNIG E，et al.Modulation of CYP79 Genes and Glucosinolate Profiles in Arabidopsis by Defense Signaling Pathways［J］.Plant Physiol，2003，131(1):298-308.

［11］KORITSAS V M，LEWIS J A，F(xiàn)ENWICK G R.Glucosinolate responses of oilseed rape，mustard and kale to mechanical wounding and infestation by cabbage stem flea beetle (Psylliodes chrysocephala)［J］.Ann Appl Biol，1991，118(1):209-221.

［12］BODNARYK R P.Effects of wounding on glucosinolates in the cotyledons of oilseed rape and mustard［J］.Phytochemistry，1992，31(8):2671-267.

［13］KIDDLE G A，DOUGHTY K J，WALLSGROVE R M.Salicylic acid-induced accumulation of glucosinolates in oilseed rape (Brassica napus)leaves［J］.J Exp Bot，1994，45(9):1343-1346.

［14］SMETANSKA B I，KRUMBEIN A，SCHREINER M，et al.Influence of salicylic acid and methyl jasmonate on glucosinolate levels in turnip［J］.J Hortic Sci Biotech，2007，82(5):690-694.

［15］BARI R，JONES J D G.Role of plant hormones in plant defence responses［J］.Plant Mol Biol，2009，69(4):473-488.