薛金愛(ài)，毛雪，吳永美，楊致榮，賈小云，張莉，王計(jì)平，岳愛(ài)琴，孫希平，李潤(rùn)植

山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801

釀酒酵母脂酰-?9脫氫酶亞細(xì)胞定位表達(dá)及其對(duì)煙草脂肪酸合成的影響

薛金愛(ài)，毛雪，吳永美，楊致榮，賈小云，張莉，王計(jì)平，岳愛(ài)琴，孫希平，李潤(rùn)植

山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801

薛金愛(ài), 毛雪, 吳永美, 等. 酵母脂酰-?9脫氫酶亞細(xì)胞定位表達(dá)及其對(duì)煙草脂肪酸合成的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2013,29(5): 630?645.

Xue JA, Mao X, Wu YM, et al. Subcellular-targeting expression of a yeast acyl-?9 desaturase and effects on fatty acid biosynthesis in tobacco. Chin J Biotech, 2013, 29(5): 630?645.

以煙草Nicotiana tabacumL.為宿主植物，分別在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)體內(nèi)定位表達(dá)釀酒酵母Saccharomyees cerevisiae脂酰-CoA-Δ9脫氫酶 (ScΔ9D)，以期提高植物組織中棕櫚油酸 (16∶1Δ9) 的積累量和分析該酶不同亞細(xì)胞定位表達(dá)對(duì)油脂代謝的影響。與野生型和空載體 (對(duì)照) 植物相比，轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片中單不飽和的棕櫚油酸及順式十八碳烯酸 (18∶1Δ11) 含量明顯提高，而飽和的棕櫚酸 (16∶0) 含量相應(yīng)減少，多不飽和的亞油酸 (18∶2Δ9,12) 和亞麻酸 (18∶3Δ9,12,15) 含量亦降低。ScΔ9D質(zhì)體定位表達(dá)煙葉中棕櫚油酸及順式十八碳烯酸含量分別是ScΔ9D細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位表達(dá)煙葉的2.7和1.9倍。這表明酵母脂酰-Δ9脫氫酶能在高等植物細(xì)胞中正確催化棕櫚酸 (16∶0) 轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸 (16∶1Δ9)，而且在質(zhì)體內(nèi)表達(dá)的效應(yīng)顯著高于在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的效應(yīng)。新建立了一種應(yīng)用脂酰-CoA-Δ9脫氫酶代謝工程培育植物組織高水平合成積累棕櫚油酸等ω-7脂肪酸的策略，有助于在生物量大的煙葉等營(yíng)養(yǎng)器官中組裝ω-7脂肪酸合成途徑以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生物燃油。

脂酰-CoA-Δ9脫氫酶，亞細(xì)胞定位表達(dá)，棕櫚油酸，ω-7脂肪酸，釀酒酵母，煙草

植物油脂不僅是人類食用油的主要來(lái)源，而且還是生物燃料及油脂化工業(yè)所需的可再生優(yōu)質(zhì)原料[1]。目前全球所消費(fèi)的植物油主要來(lái)源于大豆Glycine maxL.和油菜Brassica napusL.等普通油料作物種子油。這些油料作物種子油僅含有5種主要脂肪酸，即飽和的棕櫚酸 (16∶0)、硬脂酸 (18∶0)、單不飽和的油酸 (18∶1?9)、多不飽和的亞油酸 (18∶2?9, 12) 和亞麻酸(18∶3 ? 9, 12, 15)。

棕櫚油酸 (16∶1?9) 是一種由16個(gè)碳原子組成、含一個(gè)雙鍵的ω-7脂肪酸 (16∶1ω7)。這種重要的稀有脂肪酸在普通油料種子中含量甚微(＜1%)，但是在一些野生植物種子中能高水平積累[2]。例如，貓爪花 (草)Doxantha unguiscatiL.，澳洲堅(jiān)果Macadamia integrifolia和一種山龍眼科植物Kermadecia sinuata，其種子油分別含有64%、30%和70%的棕櫚油酸。這些高積累ω-7脂肪酸的野生植物因其種子小、產(chǎn)量低和地理分布窄等農(nóng)藝性狀差，還不能像普通油料作物那樣大規(guī)模種植和商業(yè)化生產(chǎn)種子油。

棕櫚油酸具有重要的營(yíng)養(yǎng)、醫(yī)藥和工業(yè)用價(jià)值。例如，棕櫚油酸可增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性，減少血液中膽固醇含量，防止心律失常，抑制腫瘤發(fā)生等功能[3-7]。相反，它的前體物質(zhì)棕櫚酸則被證實(shí)可引起血液中膽固醇含量升高，增加心臟性疾病和結(jié)腸癌等腫瘤疾病發(fā)生率。在工業(yè)上，新近發(fā)現(xiàn)棕櫚油酸及順式-11-十八碳烯酸(18∶1?11) 等 ω-7脂肪酸可直接用于高效生產(chǎn)工業(yè)需求量較大的1-辛烯[8-10]。棕櫚油酸還具有較好的抗低溫和抗氧化特性，非常適于制取優(yōu)質(zhì)生物柴油[11]。

棕櫚油酸的自然資源少，不能低成本商業(yè)化生產(chǎn)，難以滿足急劇增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。因此，通過(guò)對(duì)大田油料作物油脂合成途徑的遺傳修飾和組裝，以期大幅提高普通油料作物種子油中棕櫚油酸的合成積累，就成為當(dāng)今植物油脂代謝工程的一個(gè)熱點(diǎn)研究領(lǐng)域[2,9,12]。在生物體內(nèi)，脂酰-?9脫氫酶負(fù)責(zé)催化棕櫚酸 (16∶0) 生成棕櫚油酸(16∶1Δ9)[13-14]。一些不同來(lái)源的脂酰-Δ9 脫氫酶已用于提高植物棕櫚油酸含量的代謝工程，盡管目前轉(zhuǎn)基因植物種子中該脂肪酸積累量(＜10%) 遠(yuǎn)低于在高積累棕櫚油酸植物中的含量[9,12,15-19]。

釀酒酵母Saccharomyees cerevisiae脂酰-Δ9脫氫酶 (acyl-Δ9 desaturase，ScΔ9D) 是一種結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜蛋白酶，屬于 CoA-型脫氫酶，即脂酰-CoA-Δ9脫氫酶[20]。ScΔ9D負(fù)責(zé)酵母細(xì)胞不飽和脂肪酸的從頭生成，即催化細(xì)胞質(zhì)中16∶0轉(zhuǎn)化為16∶1Δ9。與前人僅在高等植物細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)脂酰 CoA-Δ9脫氫酶轉(zhuǎn)基因策略不同[18,21-23]，本文以煙草為轉(zhuǎn)基因受體，分別在質(zhì)體 (葉綠體) 中和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上定位表達(dá)酵母脂酰CoA-Δ9脫氫酶 (ScΔ9D)，解析該酶兩種不同亞細(xì)胞定位表達(dá)對(duì)靶標(biāo)脂肪酸即棕櫚油酸(16∶1?9) 和其他脂肪酸合成積累的影響及其機(jī)制。同時(shí)探討能否通過(guò)遺傳修飾使棕櫚油酸在植物營(yíng)養(yǎng)組織中大量合成積累。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酵母脂酰-CoA-Δ9脫氫酶能在高等植物細(xì)胞質(zhì)體內(nèi)催化16∶0生成16∶1Δ9。質(zhì)體表達(dá)ScΔ9D的轉(zhuǎn)基因煙葉組織中稀有單不飽和脂肪酸即棕櫚油酸 (16∶1Δ9) 及其碳鏈延長(zhǎng)產(chǎn)物順式十八碳烯酸 (18∶1Δ11) 的含量，顯著高于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位表達(dá) ScΔ9D葉組織的含量。相應(yīng)地，飽和的棕櫚酸 (16∶0) 以及多不飽和的亞油酸(18∶2Δ9, 12) 和亞麻酸 (18∶3Δ9, 12, 15) 含量減少。這一質(zhì)體定位表達(dá)脂酰-CoA-Δ9脫氫酶顯著提高植物葉組織中棕櫚油酸生物合成的策略可應(yīng)用于在生物量大的煙葉等營(yíng)養(yǎng)器官中組裝ω-7脂肪酸合成途徑以及培育優(yōu)質(zhì)燃油型煙葉新種質(zhì)的油脂代謝工程。

1 材料與方法

1.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

酵母脂酰-CoA-Δ9 脫氫酶 (ScΔ9D) 基因(GenBank Accession No. J05676.1) 的編碼序列(1 533 bp) 用高保真PCR擴(kuò)增酵母DNA獲得，并雙向測(cè)序驗(yàn)證所擴(kuò)增序列正確性。所用正反向引物分別為 ScΔ9D-F1 和 ScΔ9D-R1 (表 1)。引物中下劃線的序列分別為Hind Ⅲ、KpnⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)序列。在反向引物終止子前加有6個(gè)編碼組氨酸的密碼 (粗斜體序列)，以使成熟蛋白帶有His-tag，便于用相應(yīng)的抗體檢測(cè)該蛋白表達(dá)。同樣，擬南芥核酮糖 1,5-二磷酸羧化酶(RUBISCO) 小蛋白亞基 (GenBank Accession No. NM23 202) 的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽 (Transit peptide，TP) 編碼序列 (171 bp) 亦用高保真PCR從實(shí)驗(yàn)室保存的RUBISCO克隆載體上擴(kuò)增，并測(cè)序鑒定。所用正反向引物為 RUBISCO-F和RUBISCO-R (表1)。引物中下劃線的序列分別為Hind Ⅲ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)序列。這兩個(gè)靶序列用于構(gòu)建植物組成型表達(dá)載體。

首先，將ScΔ9D基因的編碼序列 (1 533 bp)插入 pKYLX80載體[24]35S2啟動(dòng)子和rbcs3￠終止子之間，構(gòu)建ScΔ9D組成型表達(dá)盒 (圖1A)。其次，用EcoRⅠ和ClaⅠ從pKYLX80 載體上切取ScΔ9D表達(dá)盒，并亞克隆到 pBluescript載體的多克隆位點(diǎn)，形成中間載體 (圖 1B)。最后用EcoRⅠ和XhoⅠ從pBluescript載體上切取ScΔ9D表達(dá)盒，并插入植物表達(dá)載體 pCAMBIA1301(http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html)(GenBank Accession No. AF234297.1) 的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成ScΔ9D組成型表達(dá)載體 (35SScΔ9D) (圖 1C)，用作細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位表達(dá)ScΔ9D。

將質(zhì)體引導(dǎo)肽 (TP) 的編碼序列插入到 35S啟動(dòng)子3￠末端和ScΔ9D基因5￠前端，構(gòu)建成質(zhì)體定位表達(dá)載體 (35S-TP-ScΔ9D) (圖1D)。含35S啟動(dòng)子和 rbcs3￠終止子，不含ScΔ9D序列的pCAMBIA1301載體用作對(duì)照 (35S-vector)(圖1E)。構(gòu)建的表達(dá)載體經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后，用電轉(zhuǎn)化方法 (BioRad electroporation) 將之導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciensGV3850菌株。

1.2 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

煙草N. tabacumL.品種KY160用作轉(zhuǎn)基因受體材料。采用常規(guī)的葉盤農(nóng)桿菌感染法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。煙草無(wú)菌苗培養(yǎng)、農(nóng)桿菌菌液制備及侵染、共培養(yǎng)及選擇培養(yǎng)，芽和根分化及植株再生培養(yǎng)條件和方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[16]。

1.3 轉(zhuǎn)基因煙草植株的分子鑒定

應(yīng)用 PCR 和 Southern blotting 檢測(cè)ScΔ9D基因是否整入煙草基因組。依據(jù) Junghans和Metzlaff[25]描述的快速提取DNA的實(shí)驗(yàn)方法，取植株葉片樣品提取核基因組 DNA。擴(kuò)增ScΔ9D基因的正反引物為ScΔ9D-F2和ScΔ9D-R2 (表1)。200 ng DNA 用于PCR反應(yīng)。PCR程序?yàn)椋?5 ℃變性 2 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；最后68 ℃再延伸8 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。

應(yīng)用定量 PCR (qRT-PCR) 檢測(cè)和 Northern blotting 檢測(cè)ScΔ9D基因是否有效表達(dá)。取生長(zhǎng)正常的4葉期煙草植株的葉片樣品，用Trizol試劑的方法提取總 RNA。RNA樣品用 DNase(Promega公司) 處理已消解殘余的 DNA。第一鏈cDNA合成采用Invitrogen公司SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄體系。

應(yīng)用 PrimerQuest軟件 (Integrated DNA Technologies，Coralville，IA) 設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量 PCR擴(kuò)增 147 bpScΔ9D片段的引物。正反引物為ScΔ9D-F3 和 ScΔ9D-R3 (表 1)。實(shí)時(shí)定量 PCR 應(yīng)用 SYBR GreenⅠ試劑盒 (Molecular Probes，Eugene，OR) 和iCycler iQ定量PCR儀 (Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。每個(gè) 96孔 PCR板上同一RNA樣品重復(fù)3次，各RNA樣品分別進(jìn)行3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃2 min；95 30 s℃，55 30 s℃，72 30 s℃，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。18S RNA用作內(nèi)參對(duì)照，正反引物為18S RNA-F和18S RNA-R(表 1)。依Livak和Schmittgen[26]描述的方法計(jì)算各樣品中ScΔ9D的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 ScΔ9D亞細(xì)胞定位表達(dá)的檢測(cè)

以新鮮煙葉為試材，分別分離葉綠體蛋白、微體蛋白，細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞總蛋白，用Western blotting檢測(cè)ScΔ9D酶蛋白的定位表達(dá)。

依據(jù)Roughan等[27]和Yu等[28]描述的階式蔗糖密度梯度離心法分離葉綠體蛋白、微體蛋白、細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞總蛋白。蛋白質(zhì)含量用Bradford[29]的方法測(cè)定。每樣品 35 mg蛋白用12.5% SDS-PAGE凝膠電泳分離，電泳系統(tǒng)為Mini-ProteinⅡSystem (Bio-Rad公司)。一塊膠用Semi-dry transfer blotter (Bio-Rad公司) 系統(tǒng)將分離的蛋白原位轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，電轉(zhuǎn)緩沖液為TBST (2 mmol/L Tris，192 mmol/L甘氨酸，20%甲醇，0.1% SDS)。轉(zhuǎn)印有蛋白的硝酸纖維素膜先在 TBS緩沖液 (加入 3% BSA) 中印跡反應(yīng)1 h，然后用His-tag 單克隆抗體 (1∶2 000稀釋) 印跡雜交反應(yīng) 3 h。印跡膜沖洗后，依據(jù)Amersham提供的方法，應(yīng)用ECL技術(shù)，用二級(jí)抗體 (Horseradish peroxidase-conjugated goat antimouse IgG) 檢測(cè)結(jié)合于印跡膜上蛋白的初級(jí)抗體。

1.5 總脂肪酸提取和氣相色譜 (GC) 檢測(cè)脂肪酸成分及含量

煙葉和莖桿樣品的總脂肪酸的提取依據(jù)Dahmer等[30]方法進(jìn)行。取10～20 mg 樣品放入3 mL含有 2% (V/V) 硫酸甲醇溶液的玻璃試管中，同時(shí)加入十七烷酸甘油三酯 (C17∶0) 作為內(nèi)標(biāo) (10 μg/10 mg樣品)，充分研磨后，80 ℃熱處理使樣液體積減至0.4 mL。加入1 mL含有0.01% (W/V) 丁化羥基甲苯 (BHT) 的己烷，混勻后離心。取上層 (含有脂肪酸甲酯 (FAME) 的己烷層) 用于Hewlett-Packard 5 890A氣相色譜儀 (0.25 mm i.d. ×0.33 μm×10 m FFAP 柱，火焰離子化檢測(cè)器) (Palo Alto，CA) 檢測(cè)各種脂肪酸。檢測(cè)程序 (爐溫) 設(shè)置為，起始溫度120 ℃，1 min，按12 /min ℃增溫至210 ℃，保持 3 min。然后轉(zhuǎn)為按5 /min℃加熱至235 ℃，保持8 min。進(jìn)樣口和檢測(cè)器的溫度分別是220 ℃和250 ℃。運(yùn)載氣體為氦氣，氣體流速為10 mL/min。

煙草種子脂肪酸分析參照 Li等[31]的方法，并稍作修改。取10 mg干種子放入6 cm長(zhǎng)預(yù)干燥的玻璃中，向試管中加入以下溶液：1 mL現(xiàn)配的含 5% (V/V) 硫酸的甲醇，25 μL含 0.2%BHT 的甲醇，10 μg C17∶0 (作內(nèi)標(biāo))，300 μL 甲苯助溶劑。充分混合后，90 ℃～95 ℃加熱1.5 h。冷卻到室溫后，加入1.5 mL 0.9% NaCl (W/V) 和1 mL己烷?；靹蚝笊噪x心，取上層液用于 GC測(cè)試FAMEs。GC測(cè)試條件設(shè)置同上。

所有數(shù)據(jù)都進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異顯著性用t-test 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因煙草植株的測(cè)定

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草葉盤轉(zhuǎn)化法，共獲得了137株潮霉素抗性T0代煙草植株。取T0代植株的葉片分別提取核基因組 DNA，用 Southern blotting和PCR分別鑒定ScΔ9D基因的整合。從僅有一條雜交片段的T0株系上收獲T1代種子。T1代種子在含有抗生素培養(yǎng)基上萌發(fā)，用Northern blotting 檢測(cè)T1代株系ScΔ9D基因表達(dá)。從高表達(dá)的 T1代株系收獲 T2代種子。用PCR和Real-time PCR分別檢測(cè)T2代株系ScΔ9D基因的整合及表達(dá)。在T2代株系中檢出12株空載體 (對(duì)照) 和 80株ScΔ9D轉(zhuǎn)基因。葉片樣品定量 PCR表明轉(zhuǎn)基因株系間ScΔ9D表達(dá)量有差異，但統(tǒng)計(jì)分析未達(dá)極顯著水平 (P＜0.01) (圖2)。分別選擇ScΔ9D表達(dá)量高且相似的兩類亞細(xì)胞定位表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系各 15個(gè)株系用于后續(xù)分析。

2.2 ScΔ9D蛋白的亞細(xì)胞定位

為了對(duì)質(zhì)體表達(dá)及細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的 ScΔ9D蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位，本實(shí)驗(yàn)選用T2代轉(zhuǎn)基因煙葉作為樣品，按照蔗糖密度梯度分別制備葉綠體、微粒體、細(xì)胞核和總細(xì)胞蛋白。使用蛋白質(zhì)印跡 (Western blotting) 雜交方法，鑒定 ScΔ9D蛋白的表達(dá)及定位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在35S-TP-ScΔ9D轉(zhuǎn)化的煙草樣品中，ScΔ9D 蛋白只在葉綠體和總細(xì)胞蛋白樣品中檢測(cè)到 (圖3)。相反，35S-ScΔ9D轉(zhuǎn)化的煙草樣品中，該蛋白質(zhì)卻只在微粒體蛋白和總細(xì)胞蛋白樣品中檢測(cè)到(圖3)。顯然，35S-ScΔ9D轉(zhuǎn)化的煙草，其 ScΔ9D僅在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 上表達(dá)，這與該蛋白在其酵母細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)表達(dá)定位一致。35S-TPScΔ9D轉(zhuǎn)化的煙草細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)運(yùn)肽 (TP) 指導(dǎo)下，成熟的ScΔ9D酶蛋白僅在葉綠體/質(zhì)體中表達(dá)和行使功能。

圖2 T2轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片組織中ScΔ9D mRNA的表達(dá)Fig. 2 Expression of ScΔ9D mRNA in the T2 transgenic tobacco leaves. The ScΔ9D mRNA expression was measured by quantitative real-time PCR using SYBR Green I and 18S RNA was used as internal gene reference. RNA samples were prepared from the randomly selected transgenics. RNA samples loaded in Lane 1?6 were from the cytosol-targeting expression lines of the gene while Lane 7?12 were from the plastid-targeting expression lines.

圖3 Western blotting檢測(cè)T2代轉(zhuǎn)基因煙草ScΔ9D酶蛋白的亞細(xì)胞定位Fig. 3 Subcellular localization of the ScΔ9D protein in the transgenic tobacco by Western blotting. (A) Protein samples prepared from the ScΔ9D plastid-targeting expression lines. (B) Protein samples prepared from the ScΔ9D cytosol-targeting expression lines. The proteins in Lane 1 and 5 were from the whole cell fractions. The proteins in Lane 2 and 7 were from chloroplast fractions.The proteins in Lane 3 and 6 were from microsome fraction. The proteins in Lane 4 and 8 were from nuclei fractions.

2.3 ScΔ9D轉(zhuǎn)基因煙葉組織中脂肪酸組成的變化

為了鑒別質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)定位表達(dá) ScΔ9D對(duì)營(yíng)養(yǎng)組織中脂質(zhì)合成的影響差異，我們應(yīng)用氣相色譜首先對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片組織中脂肪酸成分及其含量進(jìn)行測(cè)定。

如表2所示，在所測(cè)試的樣品中 16-和 18-碳脂肪酸都發(fā)生了一些顯著的改變。植物葉片通常情況下合成積累8%左右的特有脂肪酸16∶3。與對(duì)照和野生型相比，16∶3在 ScΔ9D表達(dá)的煙葉中含量減少，但統(tǒng)計(jì)分析未達(dá)顯著水平(P＜0.05)。然而，在質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位表達(dá) ScΔ9D的煙葉中，飽和棕櫚酸 (16∶0) 從對(duì)照和野生型植株的 18%左右分別減低為 11.1%和12.6%。相反，質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)定位表達(dá)ScΔ9D則使單不飽和棕櫚油酸 (16∶1Δ9) 含量分別增至 21.7%和 8.3%?？蛰d體轉(zhuǎn)基因和野生型煙葉僅含微量的棕櫚油酸 (＜0.51%)。對(duì)各轉(zhuǎn)基因株系脂肪酸組成變化的統(tǒng)計(jì)分析顯示 (表3)，煙葉脂肪酸成分中，伴隨16∶0含量降低，16∶1Δ9含量相應(yīng)增高，二者為負(fù)相關(guān)關(guān)系。ScΔ9D細(xì)胞質(zhì)表達(dá)株系的 16∶0和 16∶1Δ9相關(guān)系數(shù)r=?0.77**，ScΔ9D 質(zhì)體表達(dá)株系的相關(guān)系數(shù)r=?0.81**，達(dá)極顯著水平 (P＜0.01)。這兩種16碳脂肪酸含量的變化表明 ScΔ9D在高等植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上和質(zhì)體內(nèi)均能行使功能，催化16∶0生成16∶1Δ9，且在質(zhì)體內(nèi)效應(yīng)高于在細(xì)胞質(zhì)ER上的效應(yīng)。

表2 ScΔ9D轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照株系葉片組織中各脂肪酸的含量 (%)Table 2 Fatty acid content (%) in the leaves of ScΔ9D-transgenic tobacco and the controls

與16碳脂肪酸變化相似，轉(zhuǎn)基因煙葉組織中18-碳脂肪酸的比例也都發(fā)生了改變 (表2)。尤其是順式異油酸 (18∶1Δ11) 合成和積累都顯著增加，在ScΔ9D細(xì)胞質(zhì)表達(dá)株系中含量達(dá)4.7%，在ScΔ9D質(zhì)體表達(dá)株系的含量為8.9%。但在對(duì)照植物中 18∶1Δ11含量卻很少 (＜0.15%)。此外，18∶1Δ11含量增加的煙葉組織中 16∶1Δ9也增加。18∶1Δ11和16∶1Δ9含量呈正相關(guān)性，與16∶0含量為負(fù)相關(guān) (表3)。這表明轉(zhuǎn)基因植株中的16∶0生成16∶1Δ9的同時(shí)伴有18∶1Δ11的生成。顯然，18∶1Δ11是 16∶1Δ9的碳鏈延長(zhǎng)產(chǎn)物。與棕櫚酸 (16∶0) 不同，另一種重要飽和脂肪酸即硬脂酸 (18∶0) 的含量在所有檢測(cè)的材料中未見(jiàn)明顯改變。與對(duì)照煙葉相比，ScΔ9D細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的煙葉中，單不飽和油酸(18∶1Δ9) 的水平從野生型的4.5%增加至7.8%。ScΔ9D質(zhì)體定位表達(dá)的煙葉組織中該脂肪酸含量卻未觀察到明顯提高。與油酸在所測(cè)材料中的變化不同，多不飽和脂肪酸即亞油酸 (18∶2?9,12) 和亞麻酸 (18∶3?9, 12, 15) 在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體定位表達(dá) ScΔ9D的兩種轉(zhuǎn)基因煙葉組織中的含量均減少，尤其是18∶3降低了7.4%和20%。兩種多不飽和脂肪酸和16∶0含量變化表現(xiàn)為正相關(guān)，而與16∶1 Δ9含量則為負(fù)相關(guān) (表3)。

表3 ScΔ9D轉(zhuǎn)基因煙草葉片組織中各脂肪酸含量的相關(guān)系數(shù) (r)Table 3 Correlation coefficient (r) between the proportion of fatty acids (FAs) in the ScΔ9D-transgenic tobacco leaves (n=15)

2.4 ScΔ9D 轉(zhuǎn)基因煙草莖組織中脂肪酸成分的變化

ScΔ9D的表達(dá)也導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草莖組織中脂肪酸成分及含量的明顯改變 (表4)。16∶0 含量降低，而 16∶1Δ9合成顯著增加。ScΔ9D細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體定位表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草莖組織中16∶1Δ9含量分別高達(dá)7.1%和17.3%。16∶0和16∶1Δ9含量負(fù)相關(guān) (質(zhì)體表達(dá)材料為r=?0.92**，細(xì)胞質(zhì)表達(dá)材料為r=?0.86**) (表5)。與葉片情形相似，轉(zhuǎn)ScΔ9D基因煙草莖組織中18∶1Δ11與 16∶0和 16∶1Δ9含量也分別表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)和正相關(guān)。這又一次表明?；?Δ9脫氫酶在高等植物細(xì)胞的質(zhì)體內(nèi)以及細(xì)胞質(zhì)ER上均能催化16∶0生成16∶1Δ9，進(jìn)而在另一種延長(zhǎng)酶作用下生成 18∶1Δ11。其他幾種脂肪酸即18∶0、18∶1Δ9、18∶2和 18∶3在莖組織中合成積累模式與煙葉組織的相似。

2.5 ScΔ9D轉(zhuǎn)基因煙草種子脂肪酸成分變化

如表6所示，在對(duì)照和野生型煙草種子中未檢測(cè)出 16∶1Δ9和 18∶1Δ11，在轉(zhuǎn)ScΔ9D基因煙草種子中，這兩種脂肪酸含量分別為 2.0%左右和0.4%左右，相應(yīng)地16∶0含量減少1%左右。這種差異在 ScΔ9D細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體定位表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草間不明顯。其他16碳和18碳脂肪酸的合成積累在對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系間亦無(wú)顯著差異?？梢?jiàn)，35S驅(qū)動(dòng)ScΔ9D表達(dá)改變煙草種子脂肪酸組成作用有限。

2.6 ScΔ9D超表達(dá)的去飽和效應(yīng)及其對(duì)飽和脂肪酸含量的影響

為進(jìn)一步分析酵母?；?Δ9脫氫酶在高等植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上和質(zhì)體內(nèi)的催化效率，應(yīng)用公式[16∶1Δ9/(16∶0 + 16∶1Δ9)]×100 來(lái)計(jì)算棕櫚酸 (16∶0) 的去飽和指數(shù) (Index of 16∶0 desaturation)。該指數(shù)可反映16∶0被去飽和的比例。與對(duì)照植株相比，ScΔ9D轉(zhuǎn)基因植株的16∶0去飽和指數(shù)平均值提高了 39～66倍 (表 7)。ScΔ9D細(xì)胞質(zhì)ER表達(dá)的煙草葉片和莖組織中，16∶0去飽和指數(shù)分別為39.71和30.21。ScΔ9D質(zhì)體定位表達(dá)的煙草葉片和莖組織的16∶0去飽和指數(shù)分別高達(dá)66.15和54.92，遠(yuǎn)高于非轉(zhuǎn)基因煙草葉片和莖組織的去飽和指數(shù) (～2)。顯然，在轉(zhuǎn)基因煙草葉片和莖組織中，酵母?；?Δ9脫氫酶在質(zhì)體中的催化效率高于在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的催化效率。在種子中質(zhì)體表達(dá)和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)材料的16∶0去飽和指數(shù)分別為17.59和18.75，二者間無(wú)差異，但明顯低于莖葉組織中 ScΔ9D表達(dá)材料的指數(shù)值。再次說(shuō)明組成型表達(dá)ScΔ9D在種子中作用欠佳。

表4 ScΔ9D轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照株系莖組織中各脂肪酸的含量 (%)Table 4 Fatty acid content (%) in the stem tissues of ScΔ9D-transgenic tobacco and the controls

表5 ScΔ9D轉(zhuǎn)基因煙草莖組織中各脂肪酸含量的相關(guān)系數(shù)(r)Table 5 Correlation coefficient (r) between the proportion of fatty acids (FAs) in the ScΔ9D-transgenic tobacco stems (n=15)

表6 ScΔ9D轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照株系種子中各脂肪酸的含量(%)Table 6 Fatty acid content (%) in the seeds of ScΔ9D-transgenic tobacco and the controls

飽和脂肪酸含量亦是評(píng)價(jià)?；摎涿复呋实囊粋€(gè)指標(biāo)。由表 2、4和6可知，ScΔ9D的兩種亞細(xì)胞定位表達(dá)都會(huì)導(dǎo)致煙草葉片，莖和種子中飽和脂肪酸 (16∶0) 含量減少，盡管18∶0含量無(wú)明顯變化。ScΔ9D質(zhì)體定位表達(dá)的煙草飽和脂肪酸含量低于 ScΔ9D細(xì)胞質(zhì)定位表達(dá)的飽和脂肪酸含量。這又說(shuō)明質(zhì)體定位表達(dá)的ScΔ9D酶催化效率更高。

表 7 ScΔ9D轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照植株棕櫚酸 (16∶0)的去飽和指數(shù)Table 7 Index of 16:0-desaturation of the ScΔ9D transgenics and the control tobacco

3 討論

應(yīng)用代謝工程提高普通油料作物種子合成積累棕櫚油酸的常規(guī)技術(shù)策略是在種子中超表達(dá)異源脂酰-CoA-Δ9脫氫酶，或者脂酰-ACP-Δ9脫氫酶[9,12,15-19]。與前人僅在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)脂酰-CoA-Δ9脫氫酶不同，本研究在煙草營(yíng)養(yǎng)組織器官中分別進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)體 (葉綠體) 定位表達(dá)酵母脂酰-CoA-Δ9脫氫酶 (ScΔ9D)，以期分析這兩種不同亞細(xì)胞定位表達(dá) ScΔ9D的催化效率及其對(duì)植物油脂代謝和脂肪酸組成的影響。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，組成型超表達(dá)編碼酵母脂酰-CoA-Δ9脫氫酶的cDNA克隆，能將煙草葉片及莖組織中部分棕櫚酸 (16∶0) 轉(zhuǎn)化成棕櫚油酸(16∶1Δ9)，16∶0 的去飽和指數(shù)大幅增高 (表 2，4和 7)。尤其是質(zhì)體定位表達(dá)的 ScΔ9D 催化16∶0生成16∶1Δ9的效率顯著高于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位表達(dá)的 ScΔ9D。在酵母細(xì)胞中，脂酰-CoA-Δ9脫氫酶定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)催化 16∶0生成16∶1Δ9。與酵母細(xì)胞不同，高等植物細(xì)胞具有專門進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器即葉綠體。在高等植物細(xì)胞中，棕櫚酸 (16∶0) 是在葉綠體 (質(zhì)體) 內(nèi)從頭合成的，這樣便為質(zhì)體定位表達(dá)的酵母脂酰-CoA-Δ9脫氫酶就近提供了較多的底物16∶0，進(jìn)而提高了ScΔ9D的催化效率。由此推測(cè)，一些在細(xì)胞質(zhì)起作用的酶蛋白也可在質(zhì)體內(nèi)行使功能，甚至催化效率更高，使目標(biāo)化合物合成積累更多。與本研究這一發(fā)現(xiàn)相似的是，近年來(lái)一些研究將一個(gè)甚至多個(gè)細(xì)胞質(zhì)型酶蛋白導(dǎo)入葉綠體，獲得目標(biāo)化合物高水平合成[32]。例如，高等植物細(xì)胞的甲戊二羥酸途徑由6個(gè)酶蛋白組成，這一途徑在細(xì)胞質(zhì)中運(yùn)行。Kumar等[33]在煙草葉綠體中成功地定位表達(dá)了這一完整的細(xì)胞質(zhì)代謝途徑，極大地提高了煙葉組織中甲羥戊酸、胡蘿卜素、鯊烯、甾醇和三酰甘油的合成積累量。

本研究另一個(gè)發(fā)現(xiàn)是，ScΔ9D轉(zhuǎn)基因煙草莖葉組織和種子中均檢測(cè)到含量較高的順式-十八碳烯酸 (18∶1Δ11)，但非轉(zhuǎn)基因和空載體對(duì)照植株幾乎檢測(cè)不到這種稀有脂肪酸 (表2，4和6)。更為重要的是，18∶1Δ11含量與 16∶1Δ9含量呈正相關(guān)，而與16∶0含量呈負(fù)相關(guān) (表3和5)，這表明18∶1Δ11是16∶1Δ9的碳鏈延長(zhǎng)產(chǎn)物。與之相似的發(fā)現(xiàn)也在其他一些研究中獲得印證。例如，組成型表達(dá)哺乳動(dòng)物脂酰-CoA-Δ9脫氫酶的轉(zhuǎn)基因煙草莖葉組織[18]以及組成型表達(dá)貓爪花 (草)Doxantha unguis-catiL.脂酰-ACP-Δ9 脫氫酶的轉(zhuǎn)基因擬南芥Arabidopsis thaliana和油菜Brassica napusL.種子中[12]均發(fā)現(xiàn)積累較多的16∶1Δ9和18∶1Δ11。本文實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還顯示，與細(xì)胞質(zhì)定位表達(dá) ScΔ9D的轉(zhuǎn)基因植株相比，質(zhì)體定位表達(dá) ScΔ9D轉(zhuǎn)基因植株莖葉組織中18∶1Δ11的含量更高?？赡茉蚴牵谫|(zhì)體內(nèi)由于 ScΔ9D 催化 16∶0生成大量的 16∶1Δ9。16∶1Δ9是行使脂肪酸碳鏈延伸功能的酮酯酰-ACP合成酶 (KAS II) 的作用底物。足量16∶1Δ9的提供顯然增強(qiáng)了該酶活性，進(jìn)而催化生成較多的18∶1Δ11。

本文對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株的脂肪酸組成及其含量的統(tǒng)計(jì)分析表明，與對(duì)照煙草植株相比，ScΔ9D細(xì)胞質(zhì)ER定位表達(dá)也導(dǎo)致煙草莖葉組織中油酸 (18∶1Δ9) 含量增高，但ScΔ9D質(zhì)體定位表達(dá)則未引起轉(zhuǎn)基因煙草莖葉組織中油酸含量的明顯變化 (表2和4)。出現(xiàn)這樣的結(jié)果是可以理解的。離體生化實(shí)驗(yàn)已證明酵母脂酰-CoA-Δ9脫氫酶對(duì)底物16∶0和18∶0具有同等效率的催化活性[34]。與在酵母中的功能相似，細(xì)胞質(zhì)ER定位表達(dá)的ScΔ9D不僅催化16∶0生成16∶1Δ9，亦能催化 18∶0形成 18∶1Δ9。因此，與對(duì)照相比，ScΔ9D細(xì)胞質(zhì)ER定位表達(dá)的組織中18∶1Δ9含量升高。如上所述，棕櫚酸 (16∶0)從頭合成是在質(zhì)體中發(fā)生的。與胞質(zhì)相比，葉綠體/質(zhì)體內(nèi)含有較高水平的16∶0，這顯然有利于導(dǎo)入的外源酵母Δ9D酶催化16∶0生成16∶1Δ9的酶活性表達(dá)。這種變化未影響到質(zhì)體內(nèi)源脂酰-Δ9脫氫酶催化底物18∶0生成18∶1Δ9的活性。因而與對(duì)照相比，18∶1Δ9含量未發(fā)生明顯改變。轉(zhuǎn)脂酰-Δ9脫氫酶導(dǎo)致 16∶1Δ9和 18∶1Δ9含量共升高，有利于增強(qiáng)植物油抗氧化性[16,18]。

在轉(zhuǎn)ScΔ9D基因煙草組織中，隨著16∶1Δ9和18∶1Δ11的增加，多不飽和脂肪酸18∶2和18∶3含量均減少 (表2，4和6)。目前還不清楚這一現(xiàn)象是否與單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比率有關(guān)。一個(gè)可能的解釋是，植物細(xì)胞具有一個(gè)非常精細(xì)的機(jī)制能感知和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)總脂肪酸不飽和的程度。Moon等[18]發(fā)現(xiàn)，盡管脂酰-Δ9脫氫酶轉(zhuǎn)基因煙草植株組織中，單不飽和脂肪酸含量增加，飽和脂肪酸含量降低，但與對(duì)照相比，每個(gè)甘油脂分子所含雙鍵的平均數(shù)量與對(duì)照植株沒(méi)有明顯差異。因此，在超表達(dá)酵母 Δ9脫氫酶的轉(zhuǎn)基因煙草組織中，18∶2和18∶3水平的降低可解釋為是高等植物細(xì)胞對(duì)單不飽和脂肪酸含量增加的應(yīng)答回補(bǔ)機(jī)制，這樣可確保細(xì)胞內(nèi)總脂肪酸的不飽和鍵數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定。一些珍稀脂肪酸植物代謝工程研究揭示，在靶標(biāo)脂肪酸(如環(huán)氧化脂肪酸) 合成步驟的下游存在某種回補(bǔ)機(jī)制可改變其他脂肪酸組成及含量以響應(yīng)靶標(biāo)脂肪酸的積累[35]。

應(yīng)當(dāng)指出，表達(dá)不同的脂酰-Δ9脫氫酶除導(dǎo)致16∶1Δ9合成量提高外，對(duì)其他脂肪酸組成及含量的影響有較大的差異。例如，在擬南芥和油菜中組成型表達(dá)貓爪草脂酰-ACP-Δ9脫氫酶cDNA，未引起轉(zhuǎn)基因種子中總飽和脂肪酸含量明顯減少，甚至飽和脂肪酸 18∶0含量反而升高[12]。然而，本文數(shù)據(jù)顯示，酵母Δ9脫氫酶亞細(xì)胞定位表達(dá)未引起18∶0含量明顯改變，而且總飽和脂肪酸含量顯著降低。這種不一致性可能與所表達(dá)的脂酰-Δ9脫氫酶來(lái)源及活性，所用啟動(dòng)子和亞細(xì)胞表達(dá)以及宿主的不同有關(guān)。

比較轉(zhuǎn)基因煙草葉片和莖組織 16∶1Δ9合成和其他脂肪酸含量變化 (表 2和 4) 發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)定位表達(dá) ScΔ9D的葉片和莖組織間的差異明顯小于質(zhì)體定位表達(dá) ScΔ9D所產(chǎn)生的差異。質(zhì)體定位表達(dá) ScΔ9D 的煙草葉片組織 16∶1Δ9的合成量顯著高于莖組織中16∶1Δ9的積累量，這可能是葉肉細(xì)胞比莖組織薄壁細(xì)胞含有較豐富的葉綠體所致。另外，組成型超表達(dá)ScΔ9D的煙草種子16∶1Δ9合成量低，其他脂肪酸含量變化程度 (表 6) 也顯著小于莖葉組織中的改變。這也許是 35S驅(qū)動(dòng)的ScΔ9D表達(dá)載體不像在莖葉組織中那樣高效，也可能受不同植物種子的發(fā)育進(jìn)程和油脂合成途徑調(diào)控機(jī)制的影響。例如，35S驅(qū)動(dòng)脂酰-Δ9脫氫酶表達(dá)可使擬南芥種子脂肪酸組成發(fā)生顯著的改變[12]，但在大豆體細(xì)胞胚中效果不明顯[18]。

綜上所述，組成型超表達(dá)酵母脂酰-CoA-Δ9脫氫酶 (ScΔ9D) 可使煙草莖葉組織中 ω-7脂肪酸 (16∶1Δ9和18∶1Δ11) 含量明顯提高。而且，ScΔ9D在質(zhì)體中定位表達(dá)的效果遠(yuǎn)高于細(xì)胞質(zhì)定位表達(dá)，表明胞質(zhì)型脂酰-CoA-Δ9脫氫酶能在植物細(xì)胞葉綠體中行使催化16∶0生成16∶1Δ9的功能。一些葉綠體定位表達(dá)的酵母脂酰Δ9脫氫酶轉(zhuǎn)基因煙草株系的莖葉組織總脂肪酸中ω-7脂肪酸含量高達(dá)20%以上。這些轉(zhuǎn)基因煙草株系生長(zhǎng)發(fā)育表型與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵葜仓隉o(wú)異。然而，轉(zhuǎn)基因煙草莖葉組織的含油量并未提高，約2%～4%。新近一些油脂代謝工程有望培育出煙葉組織含油量＞10%的品系[36]。將本文建立的提高煙草莖葉組織16∶1Δ9和18∶1Δ11含量的技術(shù)路徑與提高煙葉等營(yíng)養(yǎng)器官總含油量代謝工程技術(shù)結(jié)合，有望培育獲得植物營(yíng)養(yǎng)器官棕櫚油酸和總含油量均高的新型煙草，專用于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生物柴油。

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September 27, 2012; Accepted: February 22, 2013

Runzhi Li. Tel: +86-354-6288374; E-mail: rli2001@hotmail.com

Expression of yeast acyl-?9 desaturase for fatty acid biosynthesis in tobacco

Jin’ai Xue, Xue Mao, Yongmei Wu, Zhirong Yang, Xiaoyun Jia, Li Zhang, Jiping Wang,Aiqin Yue, Xiping Sun, and Runzhi Li

Institute of Molecular Agriculture and Bioenergy,Shanxi Agricultural University,Taigu030801,Shanxi,China

Palmitoleic acid (16:1Δ9), an unusual monounsaturated fatty acid, is highly valued for human nutrition,medication and industry. Plant oils containing large amounts of palmitoleic acid are the ideal resource for biodiesel production. To increase accumulation of palmitoleic acid in plant tissues, we used a yeast (Saccharomyees cerevisiae)acyl-CoA-Δ9 desaturase (ScΔ9D) for cytosol- and plastid-targeting expression in tobacco (Nicotiana tabacumL.). By doing this, we also studied the effects of the subcellular-targeted expression of this enzyme on lipid synthesis and metabolism in plant system. Compared to the wild type and vector control plants, the contents of monounsaturated palmitoleic (16:1Δ9)andcis-vaccenic (18:1Δ11) were significantly enhanced in theScΔ9D-transgenic leaves whereas the levels of saturated palmitic acid (16:0) and polyunsaturated linoleic (18:2) and linolenic (18:3) acids were reduced in the transgenics. Notably,the contents of 16:1Δ9 and 18:1Δ11 in the ScΔ9D plastidal-expressed leaves were 2.7 and 1.9 folds of that in the cytosolic-expressed tissues. Statistical analysis appeared a negative correlation coefficient between 16:0 and 16:1Δ9 levels.Our data indicate that yeast cytosolic acyl-CoA-Δ9 desaturase can convert palmitic (16:0) into palmitoleic acid (16:1Δ9) in high plant cells. Moreover, this effect of the enzyme is stronger with the plastid-targeted expression than the cytosol-target expression. The present study developed a new strategy for high accumulation of ω-7 fatty acids (16:1Δ9 and18:1Δ11) in plant tissues by protein engineering of acyl-CoA-Δ9 desaturase. The findings would particularly benefit the metabolic assembly of the lipid biosynthesis pathway in the large-biomass vegetative organs such as tobacco leaves for the production of high-quality biodiesel.

Acyl-CoA-Δ9 desaturase, subcellular-targeting expression, palmitoleic acid, ω-7 fatty acid,Saccharomyees cerevisiae, tobacco

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時(shí)間：2013-03-22 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20130322.1435.001.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)