胡群山，王坤輪，史 柯，寧曉冬，菅復(fù)春，索 勛

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 450042)

絨山羊是我國的一種獨(dú)特的生物資源，其所產(chǎn)的山羊絨具有顏色潔白如玉、細(xì)而柔軟等特點(diǎn)，因此被美譽(yù)為“纖維寶石” 和“軟黃金”，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值；我國羊絨總產(chǎn)量為18 000噸，約占世界羊絨總產(chǎn)量的75%，是世界上的產(chǎn)絨大國，對發(fā)展我國經(jīng)濟(jì)、增加農(nóng)民收入做出了巨大貢獻(xiàn)。

乏質(zhì)體病(又稱無漿體病)是一種對人和動物造成嚴(yán)重危害的具有公共衛(wèi)生學(xué)意義的細(xì)胞內(nèi)專性寄生性蜱傳血液傳染病[1-2]。目前公認(rèn)的邊緣乏質(zhì)體(A.marginale)、中央乏質(zhì)體(A.centrale)、嗜吞噬細(xì)胞乏質(zhì)體(A.phagocytophilum)、綿羊乏質(zhì)體(A.ovis)、牛乏質(zhì)體(A.bovis)、扁平乏質(zhì)體(A.platys)及近年發(fā)現(xiàn)的山羊乏質(zhì)體(A.capra)可以對人和各種動物(牛、羊、犬、鼠等)及特定細(xì)胞(單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞等)產(chǎn)生危害[3-4]；其中嗜吞噬細(xì)胞乏質(zhì)體于1994年在美國被確定可以造成人粒細(xì)胞乏質(zhì)體病(Human granulocytic ehrlichia，HGE)[5]；綿羊乏質(zhì)體的變種在2007年首次被確定也可引起人的粒細(xì)胞乏質(zhì)體病[6]。該病目前被廣泛報(bào)道，已成為在世界范圍內(nèi)廣泛流行的一種在經(jīng)濟(jì)上較為重要的動物性疾病，并被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)列為綿羊、牛等動物檢疫的主要疫病之一[7-8]。我國自20世紀(jì)80年代在絨山羊中檢測到乏質(zhì)體以來，目前在內(nèi)蒙古、河南、山西、遼寧、云南、山東、西藏、新疆等地區(qū)山羊及綿羊中均檢測到某些種的乏質(zhì)體，嚴(yán)重制約我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[9-10]。

為了解我國西北地區(qū)絨山羊乏質(zhì)體病的流行及分布情況，并為該病的綜合防控提供依據(jù)，本試驗(yàn)用巢氏PCR方法對甘肅、河北、內(nèi)蒙古、山西、陜西及新疆共6個(gè)地區(qū)的乏質(zhì)體感染情況進(jìn)行了調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 387份絨山羊血液樣品，于2016年5～11月采自甘肅、河北、內(nèi)蒙古、山西、陜西及新疆共6個(gè)地區(qū)的絨山羊養(yǎng)殖場。逐只經(jīng)頸靜脈采血，每只絨山羊血液樣品 2 mL 置EDTA-K2抗凝管內(nèi)，裝入冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，置4 ℃冰箱內(nèi)保存待檢。

1.2 主要儀器及試劑 血液基因組DNA提取試劑盒(OMEGA,Norcross,GA,美國)；PCR儀(ABI，美國)；凝膠成像分析系統(tǒng)(SYNGENE，英國)；DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及JY系列電泳槽(北京市六一儀器廠)；ddH2O、rTaqDNA Polymerase、dNTP Mixture、10×PCR Buffer、LATaqDNA Polymerase、10×LA PCR Buffer、6×DNA Loading Buffer；DL-2 000 DNA marker等(TaKaRa，日本)。

1.3 DNA提取 按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取。

1.4 PCR擴(kuò)增 基于A.phagocytophilum的16S rRNA 基因，A.bovis的16S rRNA基因，A.ovis的msp4基因?qū)λ杉难簶悠愤M(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物名稱、序列及反應(yīng)條件見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。每次PCR擴(kuò)增均設(shè)陽性、陰性對照，PCR產(chǎn)物均在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

表1 乏質(zhì)體PCR所用引物及擴(kuò)增條件Table 1 Primers and amplification conditions used for Anaplasma PCR

1.5 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 22.0軟件對不同地區(qū)、不同飼養(yǎng)模式、不同年齡及不同性別絨山羊的乏質(zhì)體陽性率差異情況進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(χ2test)，P<0.05表示差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測結(jié)果 利用引物SSAP2f/SSAP2r、AB1f/AB1r、MSP4f/MSP4r對采集的387份絨山羊血液DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果檢測出A.phagocytophilum、A.bovis、A.ovis三種乏質(zhì)體，片段長度大小與預(yù)期一致(641 bp、551 bp、584 bp)(見圖1、2、3)。

圖1 A.phagocytophilum 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of A.phagocytophilum 16S rRNA geneM：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～19：PCR產(chǎn)物；20：陽性對照；21：陰性對照M:DNA marker DL2000;1～19：PCR product;20：Positive control;21:Negative control

2.2 不同地區(qū)絨山羊血液乏質(zhì)體感染情況 調(diào)查結(jié)果(見表2)顯示，絨山羊血液乏質(zhì)體總陽性率為82.4%(319/387)，其中甘肅、河北、內(nèi)蒙古、山西共4個(gè)地區(qū)乏質(zhì)體陽性率均高達(dá)100%，陜西和新疆乏質(zhì)體陽性率稍低，分別為70.6%和63.8%，表明不同地區(qū)絨山羊血液乏質(zhì)體總陽性率統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性顯著(χ2=48.747，P<0.05)。A.phagocytophilum、A.bovis和、A.ovis的陽性率分別為24.0%、34.1%和76.5%，不同種乏質(zhì)體陽性率存在顯著差異(χ2=212.972，P<0.05)。

圖2 圖2 A.bovis 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of A.bovis 16S rRNA geneM：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000;1～19：PCR產(chǎn)物;20：陽性對照;21:陰性對照.M:DNA marker DL2000;1～19:PCR product;20:Positive control;21:Negative control

圖3 A.ovis msp4基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of A.ovis msp4 geneM:DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～9:PCR產(chǎn)物；10:陽性對照；11:陰性對照；13～23:PCR產(chǎn)物M:DNA marker DL2000;1～9:PCR product;10:Positive control;11:Negative control;13～23:PCR product

表2 不同地區(qū)絨山羊血液中乏質(zhì)體感染情況Table 2 The infection rates of Anaplasma in the blood of cashmere goats from different regions (%)

2.3 不同飼養(yǎng)方式絨山羊血液乏質(zhì)體感染情況 結(jié)果(見表3)顯示，舍飼、放牧及舍飼+放牧3種飼養(yǎng)方式下乏質(zhì)體的陽性率分別為77.9%、9.2%和98.6%；舍飼+放牧方式飼養(yǎng)的絨山羊，其3種乏質(zhì)體的陽性率均顯著高于舍飼和放牧的絨山羊。不同飼養(yǎng)方式下乏質(zhì)體陽性率統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性顯著(χ2=16.095，P<0.05)。

表3 不同飼養(yǎng)方式絨山羊血液乏質(zhì)體感染情況Table 3 The infection rates of Anaplasma in the blood of cashmere goats in different feeding styles (%)

2.4 不同年齡絨山羊血液乏質(zhì)體感染情況 大于12月齡的羊乏質(zhì)體陽性率高達(dá)93.9%，3～6月齡的絨山羊乏質(zhì)體陽性率最低為65.7%，不同年齡下羊群乏質(zhì)體陽性率統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(χ2=26.88，P<0.05)。不同年齡絨山羊血液乏質(zhì)體感染情況見表4。

表4 不同年齡絨山羊血液乏質(zhì)體感染情況Table 4 The infection rates of Anaplasma in the blood of cashmere goats in different ages (%)

2.5 不同性別絨山羊血液乏質(zhì)體感染情況 雌性絨山羊及雄性絨山羊乏質(zhì)體的陽性率分別為85.1%、78.1%，差異不顯著(χ2=3.058，P>0.05)。不同性別絨山羊血液乏質(zhì)體感染情況見表5。

表5 不同性別絨山羊血液乏質(zhì)體感染情況Table 5 The infection rates of Anaplasma in the blood of cashmere goats in different genders (%)

2.6 絨山羊血液中乏質(zhì)體混合感染情況 387份絨山羊血液樣品中同時(shí)檢出2種及其以上乏質(zhì)體者占25.3%(98/387)，不同種乏質(zhì)體混合感染情況見表6。

表6 乏質(zhì)體混合感染情況Table 6 The mixed infection of Anaplasmas

3 討論

3.1 乏質(zhì)體感染在不同省區(qū)普遍存在且存在差異 孫明等[15]使用PCR方法檢測甘肅省景泰縣羊的乏質(zhì)體感染率為30.6%。Liu等[16]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，山羊的乏質(zhì)體在不同地區(qū)流行情況存在差異，河南省感染率最高(39.1%)，貴州較低(22.0%)。Zhou等[17]對重慶的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，山羊的乏質(zhì)體的感染率為34.94%。本試驗(yàn)對387份絨山羊血液樣品檢測發(fā)現(xiàn)，乏質(zhì)體總陽性率為82.4%(319/387)，高于我國其他多數(shù)地區(qū)及先前的報(bào)道，可能與所調(diào)查的絨山羊地處牧區(qū)或山區(qū)，生態(tài)環(huán)境和地形地貌復(fù)雜、植被豐富，利于硬蜱的孳生與繁衍，絨山羊易受到硬蜱的侵襲、叮咬而致乏質(zhì)體感染率較高，也可能與樣品采集時(shí)間正值硬蜱活躍季節(jié)有關(guān)。

3.2 放牧及舍飼+放牧絨山羊乏質(zhì)體感染率較高 目前，關(guān)于放牧羊群乏質(zhì)體病的報(bào)道較多，而舍飼及舍飼+放牧的較少。張菲菲[18]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，放牧模式下的羊乏質(zhì)體感染率(59.92%)明顯高于舍飼模式羊(36.75%)。張文靜等[19]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，放牧奶山羊乏質(zhì)體感染率(48.20%)顯著高于舍飼奶山羊(1.24%)。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，放牧及舍飼+放牧絨山羊乏質(zhì)體感染率(分別為79.2%、98.6%)高于舍飼絨山羊(77.9%)，與前人調(diào)查結(jié)果一致，可能與乏質(zhì)體作為蜱傳病原，放牧及舍飼+放牧的飼養(yǎng)方式增加了硬蜱接觸、叮咬羊而傳播乏質(zhì)體所致，因此在養(yǎng)羊生產(chǎn)中應(yīng)加強(qiáng)硬蜱的防控，但舍飼+放牧絨山羊乏質(zhì)體感染率顯著高于放牧和舍飼絨山羊，是否與放牧與舍飼飼養(yǎng)方式轉(zhuǎn)換降低絨山羊抗病力或與檢測樣品量較小有關(guān)，有待進(jìn)一步探討。

3.3 不同年齡絨山羊乏質(zhì)體感染率存在顯著差異 呂亞莉[20]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，<1歲的幼齡羊乏質(zhì)體感染率(34.70%)低于>1歲的大齡羊(43.41%)。Zhou等[17]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，<1歲的山羊乏質(zhì)體感染率(29.34%)低于>1歲的羊(37.96%)。本次調(diào)查結(jié)果也顯示，不同年齡段羊群乏質(zhì)體陽性率差異性顯著(χ2=26.88，P<0.05)，>1歲的羊群乏質(zhì)體感染率最高，為93.9%，顯著高于其他年齡段的羊?？赡苡捎陔S著羊的年齡增加，羊一次或多次被硬蜱叮咬而感染，但未得到及時(shí)有效治療而長期攜帶乏質(zhì)體所致。

3.4 不同性別絨山羊乏質(zhì)體感染率差異不顯著 Zhou等[17]調(diào)查表明，雄性山羊乏質(zhì)體感染率(37.23%)與雌性山羊(34.03%)不存在顯著差異。本次調(diào)查結(jié)果顯示，雖然雌性絨山羊乏質(zhì)體感染率(85.1%)高于雄性絨山羊(75.1%)，但差異不顯著。

本調(diào)查結(jié)果表明，絨山羊乏質(zhì)體感染在甘肅、河北、內(nèi)蒙古、山西、陜西和新疆6省區(qū)廣泛存在且流行情況較為嚴(yán)重，如甘肅、河北、內(nèi)蒙古、山西4個(gè)地區(qū)乏質(zhì)體陽性率均高達(dá)100%，尤其嗜吞噬細(xì)胞乏質(zhì)體作為一種人獸共患病病原，對公共衛(wèi)生安全和人類健康構(gòu)成潛在威脅，因此，應(yīng)高度重視絨山羊乏質(zhì)體病的防控和滅蜱工作，以保障人和動物健康及養(yǎng)羊業(yè)的健康快速發(fā)展。