朱小明，夏小樂，楊海麟，王 武

（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214036）

醋酸菌是嚴格好氧菌，屬于變形菌綱，有超過10個屬的一類微生物[1]，它們是重要的工業(yè)微生物，廣泛用于食醋生產(chǎn)。目前應(yīng)用于工業(yè)的食醋生產(chǎn)主要是醋酸菌中的醋酸桿菌屬和葡糖桿菌屬[2]，二者均能將乙醇氧化生成醋酸。我國食醋釀造所用的醋酸菌主要是AS1.41和滬釀1.01，二者都屬于醋酸桿菌屬中的巴氏醋桿菌，前者酒精生成醋酸的轉(zhuǎn)化率較高，但有過氧化作用，能進一步將醋酸氧化生成二氧化碳和水，后者的過氧化作用較弱[3－4]。食醋生產(chǎn)中醋酸發(fā)酵過程主要涉及到兩種酶：乙醇脫氫酶（ADH）[5]和乙醛脫氫酶（ALDH）[6]，均結(jié)合于細胞膜上，位于細胞膜外側(cè)，以PQQ[7－8]為輔酶的膜結(jié)合脫氫酶。在胞內(nèi)同時存在著以NAD為輔酶的ADH和ALDH，但它們對乙醇的氧化只通過TCA途徑和乙醛酸途徑，并不參與乙醇氧化產(chǎn)醋酸[9]。底物乙醇在膜結(jié)合乙醇脫氫酶（ADH）的催化下生成乙醛，中間產(chǎn)物乙醛接著在膜結(jié)合乙醛脫氫酶（ALDH）的作用下生產(chǎn)醋酸[10]。越來越多的研究表明，醋酸發(fā)酵是依賴于細胞膜結(jié)合的乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶完成的，其酶活水平直接影響著產(chǎn)酸。周秉承[11]的研究表明醋酸菌的產(chǎn)酸速率與菌ADH的活力有著極明顯的相關(guān)性，產(chǎn)酸速率隨著活力的升高而升高，反之亦然；Trcek等[12]比較了葡糖醋桿菌和巴氏醋桿菌發(fā)酵中的PQQ－ADH差異，發(fā)現(xiàn)葡糖醋桿菌能產(chǎn)更高濃度的酸，其PQQ－ADH的表達量也相應(yīng)較多，且PQQ－ADH的特性也表現(xiàn)出差異。醋酸菌作為一類特殊的微生物，在醋酸發(fā)酵過程中既要有一定的乙醇耐受能力，也要有一定的醋酸耐受能力。乙醇氧化生產(chǎn)醋酸的代謝途徑相對簡單，由膜結(jié)合ADH和ALDH組成產(chǎn)醋酸的關(guān)鍵酶系。但在發(fā)酵過程中，這兩者所表現(xiàn)出來的水平也不盡相同，大量的研究已經(jīng)表明PQQ－ADH與產(chǎn)酸存在直接的關(guān)系，但對發(fā)酵過程中酶系的動態(tài)變化及與產(chǎn)酸之間存在的關(guān)系闡述較少。本實驗將探究在發(fā)酵過程中脫氫酶系的變化規(guī)律，并揭示酶系與產(chǎn)酸的規(guī)律，同時探究底物乙醇及底酸乙酸對酶系的影響。通過對酶系酶活的調(diào)控，在酶系水平為提高產(chǎn)酸強度提供可能性，并為生產(chǎn)實踐提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

滬釀1.01 本實驗室保藏菌種；葡萄糖、酵母粉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、無水硫酸鎂、鐵氰化鉀、無水乙醇、40%乙醛、Triton X－100、檸檬酸、乙二胺二乙酸二鈉鹽、硫酸鐵、十二烷基硫酸鈉、95%磷酸 均為分析純；液體種子培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖10g，酵母粉10g，pH6.5，滅菌冷卻至60℃以下，再加無水乙醇40mL；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖10g，酵母粉10g，磷酸二氫鉀0.5g，無水硫酸鎂0.5g，滅菌冷卻至60℃以下，根據(jù)實驗要求添加乙醇及底酸乙酸。

無菌操作臺、振蕩培養(yǎng)箱 江蘇太倉實驗設(shè)備廠；3K15高速冷凍離心機 德國sigma公司；SONICVC－130型超聲細胞破碎儀 上海史佩林實驗室裝備有限公司；722型分光光度計 上海珂淮儀器有限公司；Bioflo115機械攪拌式發(fā)酵罐 美國NBS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子活化培養(yǎng)條件：將1mL種子甘油管接種于45mL種子培養(yǎng)基中，30℃，在170r/min下?lián)u床培養(yǎng)20～24h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將活化的種子液按10%的體積分數(shù)比接種到500mL三角瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量90mL，30℃，170r/min搖床培養(yǎng)108h。

發(fā)酵罐發(fā)酵條件：將活化的種子液按10%的體積分數(shù)比接種到7.5L的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基為3.5L，攪拌轉(zhuǎn)速400r/min，通氣量為0.2VVM，發(fā)酵溫度30℃。

1.2.2 分析方法 菌體密度：可見分光光度計于600nm（OD600）處測定吸光度。

酸度測定：0.1mol/L標準NaOH溶液滴定法，以醋酸計。

粗酶液的獲得：取相應(yīng)時間的發(fā)酵液（100mL），于4℃，8000×g條件下離心10min，用50mmol/L（pH5.8）的磷酸鹽緩沖液（KPB）洗滌2次，然后重新懸浮于該緩沖液中（0.1g濕菌體/3mL KPB），在冰浴下進行超聲破碎，240W，3s/3s，總時間10min。破碎液作為粗酶液待用。

ADH、ALDH酶活的測定：參照WOOD氏法[13]，取0.5mL Mcllvaine緩沖液（pH4.0），1.0mol/L乙醇（乙醛）溶液0.1mL，粗酶液0.1mL，6%Triton X－100 0.1mL于10mL比色管中，25℃保溫5min后加入0.1mol/L鐵氰化鉀溶液0.2mL，在25℃條件下放置反應(yīng)5min（同時做空白對照），然后加入硫酸鐵－Dupanol溶液0.5mL終止反應(yīng)，25℃下放置20min，加入3.5mL蒸餾水混合后，用紫外可見分光光度計測定660nm光密度。在25℃、pH4.0條件下，1min氧化1μmol乙醇的酶量為1個酶活力單位；4.0光密度等于氧化1μmol乙醇。

酶活性（U/mL）=A660×1/4×1/5×1/酶液（mL）×稀釋倍數(shù)

比酶活（U/mg）=酶活性（U/mL）/總蛋白（mg/mL）

2 結(jié)果與討論

2.1 醋酸分批發(fā)酵實驗

將活化的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，定時取樣分析，結(jié)果如圖1所示。醋酸菌產(chǎn)醋酸過程大致分三個階段，即高速積累期（0～42h），平緩增長期（42～60h），同化消耗期（60h～）。在發(fā)酵前期，菌體活力強，產(chǎn)酸較快。隨著菌體生長進入末期，菌體活力下降，此時產(chǎn)酸較慢。進入發(fā)酵末期，底物乙醇基本被消耗殆盡，醋酸菌產(chǎn)生過氧化現(xiàn)象，進入TCA途徑，同化醋酸生成水和二氧化碳[14]。

圖1 醋酸菌醋酸生成及酒精消耗與發(fā)酵時間的關(guān)系Fig.1 Acetic acid production and ethanol consumption in the fermentation process

2.2 醋酸發(fā)酵過程中ADH和ALDH酶活的動態(tài)分析

7L發(fā)酵罐中裝入3.5L發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后加入5%的乙醇（v/v），按10%的接種量接入種子進行發(fā)酵。定時取樣，按上述方法測定樣品的ADH和ALDH的酶活，結(jié)果見表1。從表1中可以看出，在整個醋酸發(fā)酵過程中，醋酸菌的ADH和ALDH的酶活成動態(tài)變化。發(fā)酵過程中，醋酸菌具有較高的ADH酶活性，并于36h達到酶活峰值，為8.21U/mg；醋酸菌在24～42h間以較高速率積累醋酸，而在42～60h積累速度明顯放緩。醋酸發(fā)酵進入到60h之后，ADH酶活進入低水平階段，醋酸開始出現(xiàn)同化現(xiàn)象。與ADH相似，ALDH在24～48h間酶活處于高水平，同樣在36h到達酶活峰值。但相對于ADH，ALDH在整個發(fā)酵過程中酶活水平始終較低。ADH、ALDH作為乙醇氧化代謝生成醋酸途徑中的兩個關(guān)鍵酶，其酶活水平與產(chǎn)酸速率之間可能會存在著對應(yīng)關(guān)系。表1同時反映了在發(fā)酵過程中比產(chǎn)酸速率與酶系水平的關(guān)系：在酶活水平較高時，比產(chǎn)酸速率也較快。在發(fā)酵初始階段，菌體在適應(yīng)新的環(huán)境，菌體生長處于延滯期，此時ADH和ALDH的酶活很低，可能此時酶系還未進行大量誘導(dǎo)表達，此時產(chǎn)酸速率和比生長速率接近于零。隨著菌體生長進入對數(shù)生長，比生長速率處于較高的水平，此時酶活水平顯著提高，產(chǎn)酸速率也同步加快，發(fā)酵液中開始積累大量的醋酸；隨著發(fā)酵進入穩(wěn)定期及后期，比生長速率不斷下降，酶活水平也呈急劇下降趨勢，ADH由最高的8.21U/mg下降到了接近于零，在這一時期，產(chǎn)酸速率一直下降至趨于零。

表1 醋酸發(fā)酵過程中關(guān)鍵酶系酶活力和比產(chǎn)酸速率Table 1 The specific activities of the key ezymes and specifice acetic acid production rate in the fermentation process

2.3 底物乙醇濃度對乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）表達的影響

在500mL三角瓶中裝入90mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后分別加入0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%不同濃度的乙醇，按10%的接種量接入種子。分別培養(yǎng)到菌體對數(shù)生長后期，將發(fā)酵液于4℃，8000×g條件下離心，按上述方法進行超聲破碎并進行ADH和ALDH酶活測定，結(jié)果見表2。

圖2 不同底物乙醇濃度下發(fā)酵乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）的酶活變化特征Fig.2 Enzyme activities of ADH and ALDH in different ethanol concentration

從圖2可以看出，在不同底物乙醇濃度下，醋酸菌的ADH和ALDH的活性水平發(fā)生改變。在沒有乙醇的發(fā)酵條件下，ADH和ALDH的酶活水平很低，分別為0.38U/mg和0.28U/mg。在乙醇濃度1%～3%（v/v）間，隨著培養(yǎng)基中乙醇濃度的升高，ADH和ALDH的酶活水平也提高，并在3%乙醇濃度時，ADH和ALDH的活性水平達到最高，分別為3.79U/mg和2.36U/mg。隨著乙醇濃度的再升高，ADH和ALDH的活性又開始下降；當乙醇濃度到達7%時，ADH和ALDH的酶活水平降到了很低的水平。這與發(fā)酵過程中的菌體的生長表現(xiàn)是一致的，在乙醇濃度較低時，菌體生長活躍，產(chǎn)酸較快。隨著濃度的升高，菌體生長受到抑制，產(chǎn)酸速率也相對較慢。同時，由圖2可以看出，乙醇的存在對ADH和ALDH基因的表達存在誘導(dǎo)作用，但這種誘導(dǎo)是在一定的濃度范圍內(nèi)，如超過這個濃度范圍，反而又不利于ADH和ALDH基因的表達。因此，在實際生產(chǎn)液醋過程中，可以通過控制發(fā)酵醪中乙醇的濃度在ADH和ALDH酶活水平較高的范圍內(nèi)，從而提高生產(chǎn)強度，達到從酶學(xué)水平調(diào)控發(fā)酵的目的。單純從乙醇濃度對ADH和ALDH酶活的影響，可以選擇3%乙醇濃度作為發(fā)酵培養(yǎng)基的初始乙醇濃度，對于半連續(xù)發(fā)酵，控制乙醇濃度為3%（v/v）能夠使雙酶的活性維持在一個較高的水平，對于生產(chǎn)具有實際意義。

2.4 底酸對乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）的影響

醋酸作為醋酸菌發(fā)酵的產(chǎn)物，初始培養(yǎng)基中其存在與否會對發(fā)酵產(chǎn)生一定的影響[14－15]，而酶系水平較無底酸的情況下可能會存在一定的差異。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加底酸，進行發(fā)酵罐發(fā)酵，考察底酸存在下酶系的變化規(guī)律。7L發(fā)酵罐中裝入3.5L發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后加入4%的乙醇（v/v），同時加入1%的乙酸，按10%的接種量接入種子進行發(fā)酵。定時取樣，結(jié)果分別見圖3及表2。

圖3 底酸條件下醋酸發(fā)酵特征變化Fig.3 The fermentation feature parameters in the condition of initial acetic acid

在經(jīng)歷了5h左右的延滯期后，發(fā)酵進入快速生長的對數(shù)期，乙醇也開始被快速消耗，同時酸不斷積累，發(fā)酵進行到20h左右，乙醇基本被氧化殆盡，產(chǎn)酸也基本結(jié)束，菌體此時增長緩慢。和沒有初始底酸的培養(yǎng)條件相比（圖1），發(fā)酵進程明顯加快。同時，ADH和ALDH的酶活水平也出現(xiàn)明顯差異（表2）。

與在沒有底酸的條件下的發(fā)酵對比，發(fā)酵時間大大縮短，產(chǎn)酸速率得到了較大的提高，發(fā)酵時間縮短到20h左右，說明底酸的存在對發(fā)酵有積極的促進作用。從酶系的變化來看，ADH和ALDH的比酶活都得到了較大的提高，尤其是ALDH的活性水平，最高比酶活提高了有3倍之多，最高酶活達到了7.46U/mg。二者酶活之間的差異變小，由ADH/ALDH從3.3（36h，表1）減小到了1.17（18h，表2）。

表2 底酸存在下乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）的隨時間的變化特征Table 2 The change of ADH and ALDH specific activities in the presence of initial acetic acid

在乙醇氧化生成乙酸的代謝途徑中，ALDH催化乙醛生成乙酸。底酸（乙酸）的存在可能存在一種反饋激活作用，促進雙酶基因的表達，特別是ALDH，從而大幅提高ALDH的酶活。因此，在生產(chǎn)中，在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定的酸（1%），提高ADH和ALDH的酶活水平，從而達到促進發(fā)酵、提高生產(chǎn)強度的目的。

3 結(jié)論

通過對搖瓶、發(fā)酵罐發(fā)酵對醋酸菌產(chǎn)酸關(guān)鍵酶系進行研究，擬探討其與產(chǎn)酸的關(guān)系。在分批發(fā)酵中，ADH和ALDH的酶活隨發(fā)酵時間的變化而變化，在整個過程中，ADH的酶活要高于ALDH，最高達到3.3倍，并都于36h達到峰值，分別為8.21U/mg和2.52U/mg。1%～3%（v/v）的乙醇對酶系有誘導(dǎo)作用，在此范圍內(nèi)，ADH和ALDH的水平明顯提高，但隨著乙醇濃度的增大，對酶活又出現(xiàn)抑制作用。在底酸乙酸存在的發(fā)酵條件下，發(fā)酵時間縮短，產(chǎn)酸關(guān)鍵酶系酶活水平發(fā)生了較大的變化，尤其是ALDH的酶活水平顯著提高，最高達到了7.46U/mg。

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