曾東慧，張 俊 ，陸勝民

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，浙江杭州310021)

溫州蜜柑(Satsuma mandarin)是柑橘罐頭加工的主要原料。我國柑橘罐頭占世界橘子罐頭總產(chǎn)量的75%以上，加工后剩余大量的果皮，除少量加工成陳皮外，大部分作為廢棄物填埋，造成環(huán)境污染和資源浪費［1－2］。溫州蜜柑果皮中富含多種類胡蘿卜素，其中β－隱黃素的含量是其它柑橘品種的20～30倍，具有減少黑色素的生成，預(yù)防肝臟疾病、癌癥、骨質(zhì)疏松癥、肥胖等功能，是目前研究的熱點［3－6］。類胡蘿卜素為脂溶性，目前對柑橘果皮中類胡蘿卜素的提取一般采用石油醚、丙酮、乙酸乙酯、石油醚與丙酮的混合液［7－8］等有機溶劑提取。然而有機溶劑的殘留、難以回收及環(huán)境污染等問題一直限制著提取產(chǎn)物的使用，帶來較多的食品安全和環(huán)境污染問題。超聲波可使溶劑產(chǎn)生空化效應(yīng)，空化泡破裂形成的爆破沖擊力可打破細(xì)胞壁，使溶劑很快滲透到細(xì)胞內(nèi)部。超聲波輔助提取溫州蜜柑果皮中的類胡蘿卜素比機械輔助提取縮短提取時間、提高提取率，且避免了因高溫提取對功能成分分子結(jié)構(gòu)的破壞［8－9］。響應(yīng)曲面法是一種優(yōu)化提取工藝條件較好的方法，徐媛等［10］以石油醚為提取溶劑，通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化紅葡萄柚中番茄紅素的最佳提取工藝，可獲得最佳工藝參數(shù)，與理論值誤差較小，能夠為進一步實驗研究提供理論依據(jù)。為了提高天然類胡蘿卜素的應(yīng)用，熊科等［11］采用超聲波強化無水乙醇提取胡蘿卜素干粉中β－胡蘿卜素，而通過乙醇提取柑橘果皮中的類胡蘿卜素在國內(nèi)外還未見報道。本研究以罐頭加工后廢棄的溫州蜜柑果皮為實驗材料，采用以超聲波輔助強化提取醇溶性的類胡蘿卜素，通過響應(yīng)面分析(response surface methodology，RSM)評估影響超聲波輔助提取溫州蜜柑果皮類胡蘿卜素的關(guān)鍵因素，以此得到最佳提取工藝條件和參數(shù)，為柑橘罐頭加工后的溫州蜜柑果皮中類胡蘿卜素的安全有效生產(chǎn)提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

溫州蜜柑果皮 浙江臺州第一罐頭廠生產(chǎn)罐頭后的廢棄果皮，經(jīng)陰干后粉碎至60目以上備用;甲醇、甲基叔丁基醚 色譜級，TEDIA天地試劑公司，美國;β－胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品 sigma公司，美國;2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚(butylated hydroxytoluene，BHT)、石油醚、丙酮、95%乙醇 國產(chǎn)分析純。

Waters 2690型高效液相色譜儀 美國;UV 1800型紫外分光度計 島津公司，日本;RE 52－99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;KQ 500BD型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司，中國。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取溶劑的比較 取干燥后的溫州蜜柑果皮樣品，按相應(yīng)的料液比分別加入丙酮、石油醚、丙酮∶石油醚 =2∶1(簡稱，混合液)、95%乙醇，30℃下超聲波提取8min。其中乙醇提取液，用石油醚萃取，上層為含類胡蘿卜素的溶液。紫外－可見分光光度法測定不同提取液最大吸收波長，并以β－胡蘿卜素計作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)溶劑提取類胡蘿卜素的含量。

1.2.2 兩種溶劑提取溫州蜜柑果皮中類胡蘿卜素的HPLC分析比較 取30mL提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后，用30mL石油醚(含 0.1%BHT)復(fù)溶后，加 30mL 10%KOH－甲醇溶液皂化過夜。皂化液加入20mL 10%NaCl溶液后，用石油醚溶液(含 0.1%BHT)完全萃取。上層萃取液用蒸餾水反復(fù)洗至中性后，加入適量的無水硫酸鈉干燥過濾后，35℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。樣品溶于5mL甲醇∶甲基叔丁基醚(MTBE)=1∶1溶液，0.45μm 有機膜過濾［12］。

HPLC檢測條件，色譜柱:YMC C30 Carotenoid S－5柱(YMC，250mm × 4.6mm，5μL)，柱溫，26℃;檢測波長，450nm;流動相，A 甲醇∶MTBE∶水 =81∶15∶4;B 甲醇∶MTBE∶水 =6∶90∶4，梯度洗脫 90min 內(nèi)，A 泵由100%降至0%，B泵由0%升至100%;流速為1mL/min。

1.2.3 單因素實驗 選擇超聲功率(200～400W)、超聲時間(0～12min)、超聲溫度(25～45℃)、料液比(1∶10～1∶50)、提取次數(shù)(1～3 次)作為考察因素，按照1.2.1節(jié)的方法提取溫州蜜柑果皮中的類胡蘿卜素，以類胡蘿卜素的提取含量為指標(biāo)進行單因素實驗。

1.2.4 超聲波提取響應(yīng)曲面的實驗 利用 Box－Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，在單因素實驗基礎(chǔ)上，確定響應(yīng)面設(shè)計中每個因子的適宜范圍。選取料液比、提取溫度、提取時間3個主要影響因素為自變量，因素水平及編碼值見表1。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別以石油醚、丙酮、石油醚∶丙酮=2∶1(簡稱，混合液)的溶劑精確配制40mg/L的β－胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成 1、2、3、4、5mg/L，450nm處測定吸光值3次，取平均值。以β－胡蘿卜素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

溫州蜜柑果皮中類胡蘿卜素含量:

式中:提取液濃度通過吸光值和1.2.5中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算而得，并換算成μg/mL。

表1 實驗因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of the test

1.2.6 類胡蘿卜素提取率計算 將溫州蜜柑果皮采用95%乙醇提取數(shù)次至提取液為無色時，合并提取液。采用1.2.1測定95%乙醇提取液的方法測定含量，并以此含量作為完全提取果皮中類胡蘿卜素的含量Y總類胡蘿卜素。溫州蜜柑果皮中類胡蘿卜素的提取率計算公式如下:

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel處理，其結(jié)果用平均值表示。柱形圖和折線圖采用OriginPro 7.5進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

通過實驗以β－胡蘿卜素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制各溶劑溶解所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下:

石油醚溶劑:y=0.28124x，R2=0.99956

丙酮溶劑:y=0.27387x，R2=0.99978

混合液溶劑:y=0.25710x，R2=0.99983

其中y為吸光值，x為β－胡蘿卜素質(zhì)量濃度/(mg/L)。結(jié)果表明，β－胡蘿卜素在質(zhì)量濃度1～5mg/L范圍內(nèi)與吸光值呈良好的線性關(guān)系，β－胡蘿卜素為現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 乙醇等溶劑對果皮類胡蘿卜素提取含量的影響

從圖1可知，丙酮∶石油醚=2∶1的混合液和乙醇提取溫州蜜柑果皮中類胡蘿卜素的含量較高，而石油醚和丙酮提取的含量較低。柑橘果皮中的類胡蘿卜素大多為含氧型類胡蘿卜素，如葉黃素、玉米黃素、β－隱黃素等，其極性比不含氧型類胡蘿卜素的極性強。根據(jù)溶劑相似相溶的原理，柑橘果皮中的類胡蘿卜采用極性較強的非極性溶劑提取較為合適。此外，石油醚與丙酮滲透細(xì)胞的能力較差，類胡蘿卜素不能較好地從細(xì)胞中釋放，從而提取率較低。乙醇對細(xì)胞壁的滲透能力強，能夠較好地滲透入細(xì)胞壁，從而使類胡蘿卜素較好地釋放而溶解于溶劑中。

圖1 不同溶劑對溫州蜜柑果皮類胡蘿卜素提取含量的影響Fig.1 Effect of different solvents on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

從混合液和95%乙醇提取類胡蘿卜素的HPLC圖譜(圖2)中可知，兩種溶劑提取得到的類胡蘿卜素主要組成是一樣的，說明兩種溶劑均能使柑橘皮中類胡蘿卜素較好地溶解。由于乙醇無毒、便于回收，殘留溶劑對人體健康危害少，且可安全應(yīng)用于食品等行業(yè)，因此本文采用乙醇對溫州蜜柑果皮中類胡蘿卜素進行提取。

圖2 溫州蜜柑果皮中類胡蘿卜素的HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectrum of carotenoids in the mandarin peel

2.3 超聲波功率對果皮類胡蘿卜素提取含量的影響

從圖3可知，隨著超聲波功率的加大，樣品中類胡蘿卜素提取含量先升高而后降低，當(dāng)超聲波功率為250W時，類胡蘿卜素的提取含量最高。超聲波輔助提取有助于液質(zhì)傳動，但其功率過大會使類胡蘿卜素發(fā)生降解。因此，本文選用超聲波功率為250W。

2.4 超聲波溫度對果皮類胡蘿卜素提取含量的影響

圖4表示超聲波溫度對果皮類胡蘿卜素提取含量的影響。在一定范圍內(nèi)，溫度升高能夠提高類胡蘿卜素的提取含量。溫度為35～40℃時提取含量最高，而45℃時，果皮中類胡蘿卜素的提取含量下降，可能是較高的溫度雖然可使柑橘皮細(xì)胞膜的通透性改變，使類胡蘿卜素得到較好的釋放，但其也會發(fā)生降解，因此溫度不宜過高，這與類胡蘿卜素的提取溫度不能超過35℃的研究報道［13］一致。

圖3 超聲功率對果皮類胡蘿卜素提取含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

圖4 超聲溫度對果皮類胡蘿卜素提取含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

2.5 超聲波時間對果皮類胡蘿卜素提取含量的影響

圖5表明，隨著超聲提取時間的延長，提取含量會持續(xù)增加，而后趨于穩(wěn)定。超聲提取初期隨著時間的延長，細(xì)胞破碎程度增大，細(xì)胞內(nèi)部的類胡蘿卜素開始向外擴散，使得溶劑中類胡蘿卜素的含量迅速升高。當(dāng)超聲時間達到10min左右時，提取液中類胡蘿卜素的液質(zhì)傳動達到平衡值，因而其含量趨于穩(wěn)定。

圖5 超聲時間對果皮類胡蘿卜素提取含量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

2.6 料液比對果皮類胡蘿卜素提取含量的影響

從圖6可知，隨著料液比增加，提取含量先增加，而后趨于穩(wěn)定。溶劑用量越多，傳質(zhì)動力越大，擴散到溶劑里的類胡蘿卜素就越多?？紤]到料液比太高會增加提取成本，且給后續(xù)的濃縮工作帶來不便。因此，本實驗選擇料液比1∶30g/mL左右較為合適。

圖6 料液比對果皮類胡蘿卜素提取含量的影響Fig.6 Effect of material－liquid ratio on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

2.7 提取次數(shù)對果皮類胡蘿卜素提取含量的影響

以乙醇作為溶劑，超聲功率為250W，超聲溫度為35℃，超聲時間為9min，料液比為1∶30g/mL，考察各提取次數(shù)中類胡蘿卜素的提取效果。由圖7可知，通過第一次提取后，果皮中85%類胡蘿卜素都得到了回收，而第2、3次提取僅存少量的類胡蘿卜素，為了節(jié)約溶劑的使用量，節(jié)約成本，及后期工作量，綜合考慮采用一次提取。

圖7 提取次數(shù)對果皮類胡蘿卜素提取含量的影響Fig.7 Effect of extraction times on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

2.8 響應(yīng)曲面優(yōu)化提取工藝

2.8.1 實驗結(jié)果及方差分析 以提取含量為響應(yīng)值，在單因素實驗結(jié)果上，利用Box－Behnken響應(yīng)曲面法設(shè)計三因素三水平實驗，結(jié)果見表2。將所得的實驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0.6 Trail軟件進行多元回歸擬合，得到以類胡蘿卜素提取含量對提取料液比(X1)、提取溫度(X2)、提取時間(X3)的二次多項回歸方程:

式中的料液比(X1)、溫度(X2)、時間(X3)在設(shè)計中均經(jīng)量綱線性編碼處理，因此方程中各項系數(shù)絕對值的大小直接反映了各因素對指標(biāo)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。

為了檢驗方程的有效性，對溫州蜜柑果皮中類胡蘿卜素提取含量的數(shù)學(xué)模型進行方差分析。由表3可知，一次項中，料液比(X1)、提取時間(X3)的影響顯著(p＜0.05)，提取溫度(X2)的影響不顯著(p＞0.05)。交互項均不顯著(p＞ 0.05)，而二次項中，的影響均顯著(p＜0.05)。通過對回歸方程的方差分析，可得絕對系數(shù)R2=0.9322，變異系數(shù)為5.34%，表明該方程對實驗擬合情況較好，實驗誤差小，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析和預(yù)測。同時，經(jīng)分析可知失擬項為p=0.0697 ＞0.05，未達到顯著水平，表明實驗設(shè)計合理，該模型能較好地描述變量與提取含量之間的關(guān)系。

表2 Box－Behnken響應(yīng)曲面法實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Central composite design and its result of the three variables using Box－Behnken response surface method

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

2.8.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 通過模型方程所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線，結(jié)果見圖8～圖10，料液比和溫度的相互作用較顯著。等高線的形狀可反映出交互作用的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則反之。

圖8 超聲溫度與料液比對果皮類胡蘿卜素提取含量影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.8 Response surface and contour showing the effects of ultrasonic extraction temperature and material－liquid ratio on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

圖9 超聲時間與料液比對果皮類胡蘿卜素提取含量影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.9 Response surface and contour showing the effects of ultrasonic extraction time and material－liquid ratio on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

圖10 超聲時間與溫度對果皮類胡蘿卜素提取含量影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.10 Response surface and contour showing the effects of ultrasonic extraction time and ultrasonic temperature on the yield of carotenoids extracted from the mandarin peel

通過軟件分析得最佳提取條件為，X1=1∶34.48，X2=35.93，X3=8.63，在此條件下提取類胡蘿卜素含量的理論值為349.947μg/g。經(jīng)過轉(zhuǎn)換后得到溫州蜜柑果皮中類胡蘿卜素的最佳提取條件為料液比1∶35g/mL，溫度36℃，時間9min，通過實驗得溫州蜜柑果皮中類胡蘿卜素的實際提取含量為351.25μg/g，其與理論值的相對誤差較小，提取率為85.86%，較乙醇靜置提取1h，其單次提取含量提高了22%，提取時間縮短了85%。因此利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化溫州蜜柑中類胡蘿卜素的提取工藝是有效可行的，提取率高，具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

乙醇安全無毒、便于回收，提取后殘留量少，提取類胡蘿卜素的含量高，因此乙醇用于柑橘皮中類胡蘿卜素的提取是可行的。

從超聲波輔助對溫州蜜柑果皮中類胡蘿卜素提取工藝的單因素和響應(yīng)曲面法分析，得到了超聲輔助乙醇提取類胡蘿卜素的最佳工藝條件為:采用95%乙醇溶劑進行單次提取，超聲功率250W，料液比1∶35g/mL，溫度36℃，時間9min時，測得類胡蘿卜素的提取含量為351.25μg/g，提取率為85.86%，較乙醇溶液靜置提取1h，其含量提高了22%，提取時間縮短了85%。該研究為罐頭加工后的溫州蜜柑皮中類胡蘿卜素的安全有效生產(chǎn)提供了參考。

［1］程紹南.我國柑橘加工業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2007，11:15－17

［2］單楊.中國柑橘工業(yè)的現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢與對策［J］.中國食品學(xué)報，2008，8(1):1－8.

［3］Sμgiura M，Nakamura M，Ikoma Y，et al.High serum carotenoidsareinverselyassociatedwithserum γglutamyltransferase in alcoholdrinkers within normalliver function［J］.Journal of Epidemiology，2005，15(5):180－185.

［4］Nishino H，Murakoshi M，Tokuda H，et al.Cancer prevention by carotenoids［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2009，483(2):165－168.

［5］Yamaguchi M，Weitzmann M N.The bone anabolic carotenoid beta－cryptoxanthin enhances transforming growth factor beta1－induced SMAD activation in MC3T3 preosteoblasts［J］.International Journal of Molecular Medicine，2009，24(5):671－675.

［6］Takayanagi K，Morimoto S，Shirakura Y，et al.Mechanism of Visceral Fat Reduction in Tsumura Suzuki Obese，Diabetes(TSOD)Mice Orally Administered β－Cryptoxanthin from Satsuma Mandarin Oranges(Citrus unshiu Marc)［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59(23):12342－12351.

［7］馬少君，傅虹飛，謝筆鈞，等.超聲波輔助提取甜橙果皮類胡蘿卜素研究［J］.食品科學(xué)，2010，31(29):39－44.

［8］戴喜末，熊子文，羅麗萍.響應(yīng)面法優(yōu)化野艾蒿多糖的超聲波提取及其抗氧化性研究［J］.食品科學(xué)，2011，32(8):93－97.

［9］孫明奇，張斌，潘思軼.超聲波及機械攪拌輔助提取橘皮類胡蘿卜素比較研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(6):160－163.

［10］徐媛，王魯峰，徐曉云，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化紅葡萄柚番茄紅素的提取工藝［J］.食品科學(xué)，2010，30(22):255－259.

［11］熊科，夏延斌，劉蓉，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲波強化提取醇溶性 β－胡蘿卜素［J］.食品科學(xué)，2008，29(3):140－144.

［12］陶俊，張上隆，張良誠，等.柑橘果皮顏色的形成與類胡蘿卜素組分變化的關(guān)系［J］.植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報，2003，29(2):121－126.

［13］Mele'ndez－Mart?'nez A J，Vicario I M，Heredia F J.Review:Analysis of carotenoids in orange juice［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2007，20:638－649.