劉國(guó)巖，徐展望，徐琬梨

(1 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250014;2 山東中醫(yī)藥大學(xué))

中藥骨碎補(bǔ)具有治療骨質(zhì)疏松癥和促進(jìn)骨折愈合的功效。目前，關(guān)于骨碎補(bǔ)治療機(jī)制的研究多集中在促成骨方面，核心結(jié)合因子α1(Cbfα1)是促進(jìn)骨發(fā)育和骨形成的重要因子［1］，其表達(dá)量決定了骨重建的方向。2012年3～9月，我們采用細(xì)胞生物學(xué)和藥理學(xué)方法，用骨碎補(bǔ)提取液培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，檢測(cè)BMSCs中Ⅰ型膠原及Cbfα1的表達(dá)，探討骨碎補(bǔ)在BMSCs向成骨分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 4～6周齡SD大鼠30只，雌雄不限(山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。RPMI1640培養(yǎng)基(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，胎牛血清(Gibco公司)，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液(上海麥倉(cāng)生物科技有限公司)，中藥骨碎補(bǔ)(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房)，胰蛋白酶及 L-谷氨酰胺(Sigma)。CO2培養(yǎng)箱(美國(guó) F.S)，電子分析天平(德國(guó)賽多利斯 ME235P)，圖像分析系統(tǒng)(美國(guó) Image-Pro Plus)，倒置相差顯微鏡(美國(guó) AO)。

1.2 方法

1.2.1 骨碎補(bǔ)的提取與溶液配制 取骨碎補(bǔ)600 g，加入10倍量70%乙醇回流提取2次，每次2 h。2次提取液合并后減壓回收乙醇，將提取液濃縮至300 mL，相當(dāng)于每mL含藥材2 g，4℃冰箱保存。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液(作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組培養(yǎng)液):RPMI 1640(含15%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL);含骨碎補(bǔ)醇提物培養(yǎng)液(作為實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液):在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液中加入骨碎補(bǔ)醇提物，分別形成終濃度為20、2、0.2 mg/mL的培養(yǎng)液。

1.2.2 大鼠BMSCs取材、原代與傳代培養(yǎng) 稱取大鼠體質(zhì)量，3%戊巴比妥鈉腹腔注射處死，75%乙醇浸泡消毒后，無(wú)菌條件下分離雙側(cè)股骨，置入加有雙抗液的PBS中浸泡5 min;剪去骺端，用無(wú)菌注射器吸取DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集沖洗液混勻后，按1∶1的比例緩慢疊加在淋巴細(xì)胞分離液上，離心收集中間白霧層，以獲取單核細(xì)胞，再用PBS沖洗2次，加入配置好的培養(yǎng)基，以2×10-6/mL接種于一次性培養(yǎng)皿中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后重新更換培養(yǎng)液，然后每3 d更換培養(yǎng)液1次。當(dāng)細(xì)胞成長(zhǎng)并逐漸融合到80%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代。按1∶2比例接種于新的培養(yǎng)瓶進(jìn)行第一次傳代，倒置相差顯微鏡下逐日觀察。同樣方法進(jìn)行傳代后的下代細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞分為5組:標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基組(無(wú)血清培養(yǎng)基);條件培養(yǎng)基組(地塞米松1×10-8mol/L、β-甘油磷酸鈉 10 mmol/L、VitC 50 μg/mL);中藥1組(骨碎補(bǔ)提取液20 mg/mL);中藥2組(骨碎補(bǔ)提取液2 mg/mL);中藥3組(骨碎補(bǔ)提取液0.2 mg/mL)。均于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 免疫組化染色檢測(cè)Ⅰ型膠原含量 傳代細(xì)胞培養(yǎng)后7 d采用SP染色法光鏡下觀察，棕黃色即為陽(yáng)性染色。每組取6個(gè)標(biāo)本，各組每一染色標(biāo)本在40倍物鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每一視野用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測(cè)量染色區(qū)域的總面積值和平均光密度值，然后求其乘積，5個(gè)視野的平均值代表這一染色標(biāo)本的染色陽(yáng)性均值。

1.2.5 RT-PCR方法檢測(cè) Cbfα1表達(dá) 采用 Trizol法提取總RNA，進(jìn)行RNA濃度、純度和完整性測(cè)定。分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度后進(jìn)行RT反應(yīng)及PCR擴(kuò)增。Cbfα1上游引物:5'-GGTGGTCTGAGCTGGGATAC-3'，下 游 引 物:5'-TAGGGTCAATGACACGACCA-3'，擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火1 min，共循環(huán)30次，最后72℃延伸1 min。β-action作為內(nèi)參，上游引物:5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'，下游引物:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'。擴(kuò)增條件:94℃ 5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。在骨碎補(bǔ)提取液培養(yǎng)BMSCs第7天時(shí)取RT-PCR產(chǎn)物5 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果，以Cbfα1的DNA條帶和β-action的DNA條帶灰度值比計(jì)算產(chǎn)物相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 原代培養(yǎng)接種12 h即有細(xì)胞開(kāi)始貼壁，多數(shù)以分散、克隆集落方式增殖;24 h更換培養(yǎng)液后已有大量細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞均勻、飽滿、透亮，大部分呈圓形;3～5 d時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞呈典型的集落樣生長(zhǎng)，集落之間相互靠近;5～7 d時(shí)相鄰集落融合成片達(dá)80%，細(xì)胞間界限不清，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形。傳代后生長(zhǎng)旺盛，可見(jiàn)明顯的分裂增殖，長(zhǎng)梭形均勻分布，后期呈漩渦狀排列。

2.2 各組Ⅰ型膠原含量、Cbfα1表達(dá)比較 染色7 d后標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基組及條件培養(yǎng)基組陽(yáng)性Ⅰ型膠原免疫組化染色較少，顯著低于各中藥組(P均﹤0.01)，中藥 2組顯著高于中藥 1、3組(P均﹤0.05)。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基組、條件培養(yǎng)基組Cbfα1的RTPCR檢測(cè)條帶灰度均低于各中藥組，中藥2組明顯高于中藥1、3組。見(jiàn)表1。

3 討論

BMSCs是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱、肌肉等多種中胚層細(xì)胞。從骨髓分離的間充質(zhì)細(xì)胞是誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的優(yōu)良來(lái)源［2，3］，誘導(dǎo)條件是促進(jìn)BMSCs成骨分化及提高BMSCs成骨能力的重要影響因素。近年研究證實(shí)，中藥可調(diào)控BMSCs向成骨細(xì)胞的定向分化。中藥骨碎補(bǔ)為水龍科多年生蕨類植物槲蕨的干燥根莖，味苦、溫，歸腎、肝經(jīng)，功效補(bǔ)腎強(qiáng)骨、續(xù)傷止痛，為骨傷科常用藥物［4］。體外細(xì)胞培養(yǎng)證明，骨碎補(bǔ)能促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性和增殖，增加骨形成，提高骨密度，維持骨微結(jié)構(gòu)的完整程度［5］。

表1 各組Ⅰ型膠原、Cbfα1表達(dá)比較()

表1 各組Ⅰ型膠原、Cbfα1表達(dá)比較()

注:與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基組和條件培養(yǎng)基組比較，*P＜0.01;與中藥2組比較，△P ＜0.05

組別 n 免疫組化染色陽(yáng)性均值 Cbfα1/β-action標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基組6 0.2324 ±0.012 1.007 ±0.032條件培養(yǎng)基組 6 0.3422 ±0.024 1.081 ±0.027中藥1 組 6 0.4874 ±0.014＊△ 1.144 ±0.019＊△中藥2 組 6 0.5382 ±0.009* 1.384 ±0.029*中藥3 組 6 0.4356 ±0.017＊△ 1.115 ±0.031＊△

Cbfα1是成骨細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，其不僅促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，還影響分化后成熟成骨細(xì)胞的功能，在成骨細(xì)胞系中呈高表達(dá)，是在促成骨細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于成骨細(xì)胞分化具有重要意義。Cbfα1也可促進(jìn)Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶、骨橋素等多個(gè)表型基因的表達(dá)［6，7］，反映成骨細(xì)胞分化的活躍程度。另外，Cbfα1還能促進(jìn)骨的礦化，通過(guò)調(diào)節(jié)骨骼硬化基因來(lái)平衡成骨細(xì)胞的分化及功能;通過(guò)調(diào)節(jié)BMSCs的功能來(lái)促進(jìn)骨形成［8］。Feng等［9］報(bào)道，3 月齡大鼠骨髓細(xì)胞中 Cbfα1 mRNA表達(dá)水平最高，是1月齡的3倍，表明該階段骨髓細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化加速，以適應(yīng)骨骼快速生長(zhǎng)的需求。Komori等［6］發(fā)現(xiàn)，Cbfα1基因敲除雜合子小鼠出生時(shí)其骨組織發(fā)育明顯受阻，而Cbfα1基因敲除純合子小鼠出生時(shí)則無(wú)成骨細(xì)胞和骨組織形成;Cbfα1基因反義寡核苷酸則能阻止成骨細(xì)胞分化和骨化形成。提示Cbfα1基因與成骨細(xì)胞發(fā)育、分化和骨形成過(guò)程密切相關(guān)。

目前，中藥調(diào)控對(duì)BMSCs促成骨的作用研究主要圍繞著對(duì)堿性磷酸酶及Ⅰ型膠原表達(dá)的影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察骨碎補(bǔ)培養(yǎng)BMSCs促成骨分化的Ⅰ型膠原表達(dá)和RT-PCR檢測(cè)Cbfα1的表達(dá)變化，探討骨碎補(bǔ)對(duì)Cbfα1表達(dá)的影響。結(jié)果表明，各濃度骨碎補(bǔ)提取液對(duì)BMSCs具有促進(jìn)其向成骨分化和促進(jìn)Cbfα1表達(dá)的作用，各中藥組培養(yǎng)組細(xì)胞不僅在形態(tài)結(jié)構(gòu)上、體外培養(yǎng)特性上優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基組及條件培養(yǎng)基組，且有較滿意的Ⅰ型膠原免疫組化染色陽(yáng)性率和Cbfα1轉(zhuǎn)錄率。其中2 mg/mL骨碎補(bǔ)提取液具有明顯促大鼠BMSCs成骨分化及加強(qiáng)Cbfα1表達(dá)的作用。但以往研究對(duì)不同濃度骨碎補(bǔ)提取液促進(jìn)BMSCs增殖分化的報(bào)道存在差異，2 mg/mL作為實(shí)驗(yàn)中的中等濃度只是相對(duì)計(jì)量，具體骨碎補(bǔ)提取液與促進(jìn)BMSCs向成骨分化存在怎樣一個(gè)最佳量效關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。骨碎補(bǔ)的主要活性物質(zhì)為柚皮甙，此外還有甲基丁香酚、β-2谷甾醇、原兒茶酸、新北美圣草甙、骨碎雙氫黃酮甙等多種化學(xué)物質(zhì)。骨碎補(bǔ)中誘導(dǎo)BMSCs成骨分化及促進(jìn)Cbfα1表達(dá)的具體化學(xué)成分有待進(jìn)一步證實(shí)。

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