三羥異黃酮對(duì)永久性腦梗死大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增生的影響

朱 琳，姜正林，何 鵬，施建生，馬東明，李建成，李永財(cái)，許世輝

(1 南通大學(xué)航海醫(yī)學(xué)研究所，江蘇南通 226001;2 南通大學(xué)附屬醫(yī)院;3 寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院)

三羥異黃酮(GST)屬異黃酮類植物雌激素。研究顯示，異黃酮類物質(zhì)可減小腦梗死體積，提高存活的神經(jīng)細(xì)胞數(shù);通過(guò)減弱C-fos表達(dá)來(lái)阻止大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)誘導(dǎo)的計(jì)劃性細(xì)胞死亡;激活腦內(nèi)的MAPK信號(hào)通路，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［1］。2012年3～9月，我們通過(guò)制備大鼠永久性大腦中動(dòng)脈栓塞(pMCAO)模型，觀察GST對(duì)大鼠神經(jīng)功能、腦梗死體積、神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目、神經(jīng)再生相關(guān)因子的影響，探討GST的神經(jīng)保護(hù)作用及其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增生的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 清潔級(jí)成年雄性SD大鼠170只，體質(zhì)量260～280 g，由南通大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供。GST(Sigma公司)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(NCAM)、肌腱蛋白C(TN-C)、髓鞘相關(guān)生長(zhǎng)抑制因子(Nogo-A)、膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海繼錦化學(xué)科技有限公司)，兔抗 Nestin抗體(N5413，Sigma公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的猴抗鼠IgG(Jackson)和FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 將大鼠分為假手術(shù)組、缺血對(duì)照組、GST治療組。采用線栓法制作pMCAO模型。將大鼠用10%水合氯醛麻醉，仰臥固定，沿頸部正中線切開(kāi)，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，結(jié)扎CCA近心端及ECA起始部，止血夾夾閉ICA，在CCA上作一小切口，將直徑0.18 mm的栓線從CCA插入ICA，直至有阻力為止，說(shuō)明栓線穿過(guò)MCA起始段并達(dá)到大腦前動(dòng)脈(ACA)近端。栓線插入深度距ECA分叉處(18.5±0.5)mm。結(jié)扎固定栓線，縫合皮膚。假手術(shù)組栓線只插入1 cm，其余步驟同模型組。動(dòng)物蘇醒后對(duì)側(cè)肢體痛覺(jué)刺激缺失及運(yùn)動(dòng)障礙即為模型成功。

術(shù)后3 h開(kāi)始腹腔注射用藥，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、尼氏染色觀察時(shí)GST治療劑量分為50、100 μg/kg;腦梗死體積測(cè)定、BrdU-Nestin免疫熒光雙標(biāo)、ELISA 檢測(cè)時(shí) GST 劑量為50 μg/kg，每24 h 1次，直到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。排除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡的大鼠后，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分四組各9只，尼氏染色四組各7只，腦梗死體積測(cè)定三組各9只，BrdU-Nestin免疫熒光雙標(biāo)三組各8只，神經(jīng)再生相關(guān)因子測(cè)定三組各6只。

1.2.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 于術(shù)前及術(shù)后1、2、3、4、5 d，參照改進(jìn)的神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)分(18分制)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。1～6分提示輕度損害，7～12分提示中度損害，13～18分提示嚴(yán)重?fù)p害。

1.2.3 腦梗死體積測(cè)量 術(shù)后72 h，大鼠深度麻醉后，迅速斷頭取腦，去除嗅球放入腦槽，-20℃冷凍10 min。從額極到枕極作2 mm厚連續(xù)額狀切片，將腦片放入1%TTC溶液中，37℃避光孵育30 min，4%多聚甲醛緩沖液中固定，過(guò)夜。拍照并輸入計(jì)算機(jī)，用Image Pro Plus圖像處理軟件計(jì)算梗死面積。

1.2.4 神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù) 將大鼠麻醉，350 mL生理鹽水快速心臟灌注后，繼續(xù)用4℃的4%多聚甲醛灌注，取腦，多聚甲醛固定，20%、30%的蔗糖梯度脫水，切片做尼氏染色，高倍鏡下分別計(jì)數(shù)前囟后1.70～2.30 mm缺血側(cè)海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、Cortex區(qū)完整的錐體細(xì)胞數(shù)目，每張切片計(jì)數(shù)3個(gè)區(qū)域，連續(xù)觀察7張腦片，取平均數(shù)。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)與細(xì)胞計(jì)數(shù) 大鼠術(shù)后第3、4、5天分別腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)溶液50 mg/kg，2次/d。于術(shù)后第6天灌注、取材、固定、脫水、切片，進(jìn)行BrdU-Nestin免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)，BrdU和Nestin共標(biāo)的細(xì)胞為增生的神經(jīng)干細(xì)胞。在缺血側(cè)海馬區(qū)的前、中、后部取3張腦片，免疫熒光顯色后，用熒光顯微鏡采集圖片，將雙標(biāo)的圖片拼合，高倍鏡下計(jì)數(shù)皮質(zhì)缺血損傷區(qū)周邊、海馬CA3和海馬CA1區(qū)重合的細(xì)胞數(shù)，取3張腦片的平均值作為該大鼠缺血側(cè)該區(qū)域的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 神經(jīng)再生相關(guān)因子檢測(cè) 大鼠術(shù)后第5天斷頭取腦，組織勻漿，提取蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。采用大鼠ELISA試劑盒測(cè)定 NGF、NCAM、TN-C、GDNF、Nogo-A 濃度。取出板條復(fù)溫后，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫浴并徹底洗滌，底物TMB顯色，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度OD值，計(jì)算樣品濃度，然后再用樣品濃度除以總的蛋白濃度，得出單位總蛋白中所含樣品的量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以表示，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分采用秩和檢驗(yàn);其余數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩兩比較用Scheffe法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GST對(duì)pMCAO大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)分的影響 見(jiàn)表1。

2.2 GST對(duì)pMCAO大鼠腦梗死體積的影響 術(shù)后72 h TTC染色顯示，梗死區(qū)與右側(cè)MCA供血區(qū)一致。缺血對(duì)照組梗死體積為(29.80±1.64)%，GST 50 μg/kg治療組為(19.73 ±1.72)%，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)分比較(分，)

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)分比較(分，)

注:與缺血對(duì)照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)分第1天 第2天 第3天 第4天 第5天缺血對(duì)照組 9 8.333 ±0.558 8.333 ±0.615 7.833 ±0.703 8.000±0.000 7.667 ±0.211 GST治療組50 μg/kg 9 9.000 ±0.655 8.000 ±0.488 6.857 ±0.261 6.714 ±0.286＊＊ 5.286 ±0.421*100 μg/kg 9 7.667 ±0.441 7.222 ±0.494 6.556 ±0.444 6.000 ±0.408＊＊ 5.667 ±0.333＊＊

2.3 GST對(duì)pMCAO大鼠腦細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目的影響 術(shù)后5 d腦組織尼氏染色顯示，假手術(shù)組海馬CA1、CA3區(qū)細(xì)胞層次清楚，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)均勻，胞核圓大;皮質(zhì)部神經(jīng)元形態(tài)無(wú)明顯異常，細(xì)胞排列較緊密，胞核飽滿，核仁清晰。缺血對(duì)照組缺血側(cè)海馬CA1、CA3區(qū)細(xì)胞排列紊亂、形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞缺失，胞核固縮;缺血側(cè)皮質(zhì)部著色明顯變淡，神經(jīng)元縮小變形，核固縮。GST 50 μg/kg治療組和100 μg/kg治療組缺血側(cè)相應(yīng)區(qū)域細(xì)胞排列較規(guī)整，形態(tài)基本正常，細(xì)胞略有丟失。各組海馬區(qū)錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)比較見(jiàn)表2。

表2 各組海馬區(qū)椎體細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(個(gè)/H，)

表2 各組海馬區(qū)椎體細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(個(gè)/H，)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與低劑量組比較，△P＜0.01

＊＊假手術(shù)組 7 78.217 ±2.573＊＊ 67.191 ±2.380＊＊ 104.116 ±3.509缺血對(duì)照組 7 53.867 ±1.623 54.250 ±2.492 59.083 ±6.991 GST治療組50 μg/kg 7 69.583 ±0.773＊＊ 60.217 ±2.376* 85.716 ±2.281＊＊100 μg/kg 7 70.668 ±1.935＊＊ 68.945 ±0.925＊＊△102.723 ±1.303＊＊△

2.4 GST對(duì)pMCAO大鼠神經(jīng)再生相關(guān)因子表達(dá)的影響 見(jiàn)表3。

表3 各組神經(jīng)再生相關(guān)因子在腦組織中表達(dá)量的變化(ng/mL，)

表3 各組神經(jīng)再生相關(guān)因子在腦組織中表達(dá)量的變化(ng/mL，)

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.01;與缺血對(duì)照組比較，#P ＜0.01

組別 n GDNF NCAM NGF Nogo-A TN-C假手術(shù)組 6 215.900 ±24.132 1.293 ±0.082 15.628 ±1.637 0.339 ±0.047 25.651 ± 2.937缺血對(duì)照組 6 452.700 ±18.744* 5.993 ±0.742* 41.816 ±4.211* 0.782 ±0.047* 115.900 ±17.625*GST 治療組 6 571.500 ±42.673*# 10.023 ±1.475*# 63.095 ±6.453*# 1.078 ±0.117* 169.300 ±11.925*#

2.5 GST對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增生的影響 大鼠pMCAO 5 d后，缺血對(duì)照組和GST治療組皮質(zhì)損傷區(qū)周邊均有增生的神經(jīng)干細(xì)胞，BrdU-Nestin陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(15.210 ±1.270)、(22.500 ±0.430)個(gè)/HP。與缺血對(duì)照組的(1.000±0.200)個(gè)/HP 相比，GST 治療組增生的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P＜0.01)。

3 討論

GST是從天然植物中提取的異黃酮類雌激素，具有與雌激素類似的作用，而無(wú)雌激素的嚴(yán)重不良反應(yīng)。異黃酮類物質(zhì)具有神經(jīng)保護(hù)作用。慈春增等［2］發(fā)現(xiàn)，GST對(duì)腦缺血后卵巢去勢(shì)雌性大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用，可提高其學(xué)習(xí)記憶的能力。腦缺血后主要的損傷機(jī)制包括氧自由基、興奮性氨基酸的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，GST可減少大鼠pMCAO局灶性永久性腦梗死體積，改善神經(jīng)行為學(xué)癥狀，減少缺血損傷后神經(jīng)元的丟失，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增生，增加神經(jīng)再生相關(guān)因子在腦組織中的表達(dá)，表明GST對(duì)大鼠永久性腦缺血損傷具有明顯的神經(jīng)保護(hù)及促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增生的作用。其作用機(jī)制可能與擴(kuò)張血管，增加腦血流量，改善腦缺血缺氧，清除氧自由基，減輕腦水腫，抑制炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)［1，2］。本研究還發(fā)現(xiàn)，腦損傷后缺血灶周圍腦組織中的神經(jīng)再生相關(guān)因子 NGF、NCAM、TN-C、Nogo-A、GDNF 表達(dá)增加，GST治療可進(jìn)一步升高上述神經(jīng)再生相關(guān)因子的表達(dá)量。

新生鼠缺氧缺血性腦損傷時(shí)，NGF和BDNF能減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡［3］，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。雄性新西蘭家兔MCAO 2、3、5 h后，NGF治療可顯著改善神經(jīng)功能障礙，減少腦梗死體積、神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)［4］。由小干擾RNA(siRNA)引起的NCAM下調(diào)在小鼠MCAO模型中可導(dǎo)致腦梗死體積增大，顯著加劇神經(jīng)元損害［5］。GDNF對(duì)缺血性腦損傷基于直接保護(hù)作用，局部應(yīng)用可顯著減小MCAO大鼠的腦梗死體積、減輕腦水腫［6］。Nogo-A蛋白導(dǎo)入體外培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元能拮抗由外源性H2O2引起的氧化應(yīng)激［7］。提示GST對(duì)腦缺血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用可能與上調(diào)上述因子的表達(dá)、營(yíng)養(yǎng)與保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷有關(guān)。

NGF可與酪氨酸激酶受體TrkA、TrkB、TrkC和常見(jiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體p75NTR結(jié)合，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、軸突生長(zhǎng)、突觸重塑和神經(jīng)傳導(dǎo)，還可調(diào)節(jié)生長(zhǎng)錐和軸突中F-肌動(dòng)蛋白的聚合和積累刺激軸突生長(zhǎng)［8］。NCAM介導(dǎo)多種細(xì)胞—細(xì)胞間的相互作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的不同方面，包括細(xì)胞遷移、軸突生長(zhǎng)和突觸的形成都有重要作用［9］。有研究顯示，Nogo-A參與繼發(fā)性軸索變性，下調(diào)Nogo-A的表達(dá)可減少軸索損傷、增強(qiáng)軸突再生，抑制Nogo-A可減少M(fèi)CAO大鼠的丘腦神經(jīng)元損傷［10］。GDNF通過(guò)糖基磷脂酰肌醇錨定的細(xì)胞表面受體、GDNF家族受體α1調(diào)節(jié)細(xì)胞活性，通過(guò)跨膜RET酪氨酸受體信號(hào)通路或神經(jīng)細(xì)胞黏附分子促進(jìn)細(xì)胞的存活、軸突生長(zhǎng)和突觸形成［11］。脊髓損傷后，GDNF通過(guò)MEK-ERK信號(hào)通路作用增強(qiáng)軸突生長(zhǎng)、突觸連接以及 GABA能神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，改善功能障礙［12］。在體研究表明，TN-C可由參與髓鞘形成的施萬(wàn)細(xì)胞合成，其沿生長(zhǎng)錐伸展的路徑分布，有軸突誘導(dǎo)功能。胎鼠脊髓神經(jīng)元缺氣損傷模型研究表明，TN-C可明顯促進(jìn)神經(jīng)元的活性及突起生長(zhǎng)［13］。因此，GST通過(guò)增強(qiáng)上述神經(jīng)再生相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)、突觸重塑，改善神經(jīng)功能缺損癥狀。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，不同的細(xì)胞因子在神經(jīng)干細(xì)胞增生、遷移、分化，最終形成神經(jīng)系統(tǒng)的各類細(xì)胞過(guò)程中具有重要作用。NCAM廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在細(xì)胞增生、遷移、軸突生長(zhǎng)和突觸重塑中有重要作用。NCAM和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體相互作用，激活MAPK/ERK信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移和分化［14］。作為發(fā)育中神經(jīng)組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，TN-C與細(xì)胞增殖、遷移和形態(tài)相關(guān)。TN-C能促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的發(fā)育程序調(diào)節(jié)蛋白增殖及向髓鞘形成區(qū)域遷移［15］。GDNF對(duì)不同的外周神經(jīng)元的存活、增殖和分化是必不可少的，在缺血缺氧新生大鼠模型中植入多能星形膠質(zhì)干細(xì)胞，NGF、GDNF能促進(jìn)干細(xì)胞的遷移和分化［16］。Nogo-A可調(diào)節(jié)體內(nèi)的腦皮層神經(jīng)元的遷移，敲小鼠敲除Nogo-A基因后，其前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的遷移會(huì)受到干擾。本研究發(fā)現(xiàn)，GST治療組BrdU-Nestin共標(biāo)的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目明顯增多，表明GST可能通過(guò)刺激以上因子表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增生，繼而分化為具有功能的神經(jīng)元，并遷移到相關(guān)功能區(qū)，促進(jìn)損傷腦組織的修復(fù)與神經(jīng)功能的恢復(fù)。

綜上所述，GST對(duì)缺血損傷腦組織具有保護(hù)作用，可促進(jìn)缺血損傷后神經(jīng)再生相關(guān)因子的表達(dá)和神經(jīng)干細(xì)胞的增生，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，這為臨床應(yīng)用GST治療缺血性卒中提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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