張建華，楊成勝，岳紹中，可秋萍，婁 瑩

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

急性髓系白血病(AML)是兒童造血組織的惡性增殖性疾病，白細(xì)胞在生長(zhǎng)、分化和發(fā)育的一定階段發(fā)生惡性變，使其喪失正常的功能，導(dǎo)致惡性克隆性病變無節(jié)制的增殖，全身器官、組織廣泛浸潤(rùn)，破壞其正常的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致機(jī)體器官衰竭。近年來，隨著化療、造血干細(xì)胞移植和支持療法的不斷改進(jìn)，兒童白血病的臨床療效大為改善，但鑒于兒童白血病在免疫學(xué)分型、治療上與成人有較大的差別，其對(duì)治愈率及其預(yù)后均提出更高的要求。2010年5月～2011年9月，我們檢測(cè)了Notch信號(hào)通路中相關(guān)分子 Notch1、Notch2、Jagged1、Jagged2、Delta4在兒童AML中的表達(dá)情況，探討了Notch信號(hào)通路相關(guān)分子在兒童AML發(fā)病中的作用，為白血病的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院初診的AML患兒20例(AML組)，男13例、女7例，年齡2～13歲、中位年齡7.8歲。同期選擇我院完全緩解的AML患兒20例(對(duì)照組)，男10例、女10例，年齡1～13歲、中位年齡6.5歲。兩組均經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫分型、染色體核型分析、融合基因檢查確診，符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。兩組性別、年齡具有可比性，

1.2 檢測(cè)方法 ①提取單個(gè)核細(xì)胞:無菌條件下抽取患兒新鮮骨髓5 mL，EDTA抗凝;移至離心管中，每1 mL加入5 mL紅細(xì)胞裂解液，混勻后靜置冰上3 min，4℃ 750 r/min離心3 min;棄上清液加2 mL紅細(xì)胞裂解液，混勻后至冰上1 min，4℃ 750 r/min離心3 min;棄上清液加1 mL Trizol液，用移液器吹打使紅細(xì)胞充分裂解，常溫靜置5 min，置于－80℃保存，用于RNA制備。②RNA的提取及純度和濃度的測(cè)定:用Trizol試劑提取細(xì)胞總 RNA;提取4 μL RNA，加入DEPC液至1 mL，在用DEPC水校正過的紫外分光光度儀上進(jìn)行測(cè)定。在波長(zhǎng)為260 nm和280 nm處分別有2個(gè)讀數(shù)OD260值和OD280值，通過兩者的比值(OD260值/OD280值)計(jì)算RNA的純度?？俁NA樣品含量的計(jì)算:在260 nm波長(zhǎng)的紫外線下，1 OD=40 μg/mL RNA。RNA樣品濃度(μg/μL)=OD260值 × 核酸稀釋的倍數(shù) ×40/1000。樣本總 RNA OD260值/OD280值的比值范圍在1.8～2.0。如果比值太小，說明樣品中殘存的蛋白質(zhì)或者其他雜質(zhì)含量較多，則需要重新應(yīng)用酚/氯仿提取。③cDNA鏈的合成:逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL，包括總 RNA 2 μL，Oligo(dT)181 μL，DEPC 水 9 μL，混勻后65℃ 5 min，冰浴1 min后加入5×reaction buffer 4 μL，RNasin 1 μL，100 mmol/L dNTP mix 2 μL，M-MulV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，混勻 42 ℃逆轉(zhuǎn)錄 60 min，70℃加熱5 min，產(chǎn)物于－20℃保存。④實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)體系:以β-actin為內(nèi)參，取cDNA 5 μL，分別加入 Template 1 μL，Primer11 μL，Primer21 μL，2 × SYBR Green Master 12.5 μL，加 ddH2O補(bǔ)足至總體積25 μL。反應(yīng)條件:94℃變性5 min;94℃ 30 s，58℃ 1 min，循環(huán)30次;72℃延伸10 min。取 PCR 產(chǎn)物5 μL+6 × loading buffer 1 μL 混勻，加入1.5%瓊脂糖凝膠的加樣孔中，應(yīng)用羅氏Lightcycler2.0定量分析儀進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)。Notch信號(hào)通路中各基因引物及探針序列見表1。

表1 Notch信號(hào)通路中各基因引物及探針序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

AML組和對(duì)照組受體Notch1、配體Jagged2、配體Delta4表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)，受體 Notch2、配體 Jagged1表達(dá)水平比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。見表2。

3 討論

目前在哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)4個(gè)同源Notch受體和5個(gè)同源配體，其中同源受體是Notch1～4，分別定位于染色體 9q34.3、lp13 ～ p11、19p13.2 ～ p13.1和6p21.3;同源配體有2類，即Delta樣配體和Serrate樣配體，前者包括 Delta1、Delta3、Delta4，后者包括Jagged1和Jagged2。Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路由Notch受體蛋白、Notch配體蛋白、CSL(DNA結(jié)合蛋白)、靶分子組成。在Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，Notch受體與配體結(jié)合，通過γ分泌酶復(fù)合物介導(dǎo)的酶切活化將Notch受體從細(xì)胞膜釋放入胞內(nèi)區(qū)，后者是可溶性的Notch活化形式(ICN)，ICN轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核并與CSL DNA結(jié)合蛋白相互作用，形成轉(zhuǎn)化活化因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。目前Notch基因在成人急性白血病發(fā)病機(jī)制中的作用研究較多，并且在臨床上已經(jīng)成為一個(gè)合理的分子靶向治療位點(diǎn)，但鑒于兒童白血病在分型、治療、預(yù)后等方面與成人有較大差別，是否適用于兒童還有待進(jìn)一步研究。

表2 兩組Notch信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)比較()

表2 兩組Notch信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)比較()

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.01

組別 n 受體Notch1 Notch2配體Jagged1 Jagged2 Delta4 AML 組 20 9651.2 ±821.5* 307.5 ±174.2 4803.5 ±3553.8 5291.2 ±102.3* 16749.3 ±382.7*對(duì)照組 20 327.1 ±135.7 250.3 ±186.2 5311.9 ±3880.5 143.7 ± 25.3 803.5 ±183.2

研究顯示，在AML患者中存在有核磷酸蛋白基因的突變，尤其在正常核型的AML是最常見的分子遺傳學(xué)異常，具有重要的臨床意義［2］。Tohda等發(fā)現(xiàn)，AML患者可高度表達(dá) Notch1蛋白;Palomero等［3］發(fā)現(xiàn)，在AML患兒體內(nèi)存在激活的Notch1基因突變，AML初診患者及AML完全緩解患者HES1表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組。提示在AML體內(nèi)存在Notch信號(hào)通路的異?；罨?，且AML完全緩解患者HES1表達(dá)水平高于AML初診患者。Kogoshi等［4］提出，GSI可使敏感的AML中 HES1 mRNA明顯升高。以上均提示，在AML的發(fā)病過程中，Notch信號(hào)通路通過其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用。Yan等［5］發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路相關(guān)基因可能與AML的耐藥性有關(guān)。最近應(yīng)用熒光素酶檢測(cè)法研究表明，在AML有11號(hào)染色體倒置和骨髓增生異常綜合征患者中存在MLL基因和MAML2基因融合，從而影響 Notch 的活化［6］。

本研究發(fā)現(xiàn)，Notch1、Notch2、Jagged1、Jagged2、Delta4在正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞中都有表達(dá)，提示Notch信號(hào)通路分子廣泛表達(dá)于骨髓，調(diào)節(jié)正常造血;而AML組骨髓中受體Notch1和配體Jagged2、Delta4的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，受體Notch2、配體Jagged1的表達(dá)在兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示在兒童AML的發(fā)病過程中，白血病細(xì)胞在分子水平上發(fā)生了改變，使得 Notch信號(hào)分子異常表達(dá)，Notch信號(hào)通路中各個(gè)分子之間通過相互聯(lián)系和作用，并且與其他信號(hào)通路形成交互通話，造成調(diào)節(jié)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)失衡，進(jìn)而可能導(dǎo)致AML的發(fā)生、發(fā)展。研究表明，在兒童AML中，Notch信號(hào)通路中分子的表達(dá)水平并不一致，提示可能存在不同的致癌信號(hào)途徑或其他未發(fā)現(xiàn)的相關(guān)因素參與調(diào)控，使細(xì)胞所在的微環(huán)境或Notch受體、配體等相關(guān)分子量及活性發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞周期抑制、凋亡等不同結(jié)果［7］。

綜上所述，在兒童AML中存在Notch信號(hào)通路的異常表達(dá)，為揭示兒童AML的發(fā)病機(jī)制提供了新的理論依據(jù)，并為兒童白血病的分子靶向治療開辟了新的途徑。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組，中華兒科雜志編輯委員會(huì).兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議(第三次修訂草案)［J］.中華兒科雜志，2006，44(5):392-395.

［2］顏靈芝，陳蘇寧，梁建英，等.急性髓系白血病患者NPM1基因突變分析［J］.中華血液學(xué)雜志，2007，28(5):289-293.

［3］Palomero T，McKenna K，O-Neil J，et al.Activating mutations in NOTCH1 inacute myeloid leukemia and lineage switch leukemias［J］.Leukemia，2006，20(11):1963-1966.

［4］Kogoshi H，Sato T，Koyama T，et al.Gamma-secretase inhibitors suppress the growth of leukemia and lymphoma cells［J］.Oncol Rep，2007，18(1):77-80.

［5］Yan S，Ma D，Ji M，et al.Expression profile of Notch-related genes in multidrug resistant K562/A02 cells compared with parental K562 cells［J］.Int Lab Hematol，2009，32(2):150-158.

［6］Nemoto N，Suzukawa K，Shimizu S，et al.Identification of a novel fusion gene MLL-MAML2 insecondary acute myelogenous leukemia and myelodysplastic syndrome with inv(11)(q21q23)［J］.Genes Chromosomes Cancer，2007，46(9):813-819.

［7］Tohda S.Functional analysis of notch in the pathophysiology of leukemia［J］.Rinsho Byori，2009，57(4):351-356.