殷海松，秦韶燕，喬長晟，賈士儒

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；3.瑞奇外科器械（中國）有限公司，天津 300457）

冬蟲夏草液體種子培養(yǎng)條件的優(yōu)化

殷海松1，2，秦韶燕3，喬長晟2，賈士儒2

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；3.瑞奇外科器械（中國）有限公司，天津 300457）

摘 要：在搖瓶液體培養(yǎng)條件下，優(yōu)化冬蟲夏草液體種子培養(yǎng)條件，采用單因素和正交試驗法，研究了不同培養(yǎng)條件對冬蟲夏草液體細胞生長的影響。結(jié)果表明，在所考察的因素中，冬蟲夏草液體種子最優(yōu)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度24℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，裝液量30%（75 mL/250 mL）。在此條件下，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，獲得最大菌體干重為10.45 g/L。

關(guān)鍵詞：冬蟲夏草；培養(yǎng)條件；正交試驗；溫度；轉(zhuǎn)速；裝液量

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis.）隸屬于真菌界（Fungi）、真菌門（Eumycota）、子囊菌亞門（Ascomycotina），子囊菌綱（Ascomycetes）、肉座菌目（Hyposcreales）、麥角菌科（Clavicipitaceae）、蟲草屬（Cordyceps spp），是麥角菌科真菌冬蟲夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體。主要分布于青海、西藏、四川、云南、甘肅、貴州等地高寒地帶和雪山草原等省區(qū)[1-2]。

冬蟲夏草具有補虛損，益精氣，止咳化痰。治痰飲喘嗽，虛喘，癆嗽，咯血，自汗盜汗，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后久虛不復(fù)等功效，在中國從古代就被廣泛用作滋補食品或補藥。腺苷、蟲草酸和蟲草素是冬蟲夏草的主要活性物質(zhì)[3]。但由于過度采集，自然界中野生蟲草越來越少，而且價格很高。冬蟲夏草液體發(fā)酵培養(yǎng)，國內(nèi)外均有很多研究報道，并有一系列藥品和保健食品在市場上銷售，而且經(jīng)多年的臨床使用，冬蟲夏草人工菌絲制品的藥理作用與天然冬蟲夏草幾乎一致[4]，個別有益指標(biāo)高于天然冬蟲夏草，但其價格要遠遠低于天然蟲草。因此通過冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵獲得菌絲體和代謝產(chǎn)物非常有實際價值。

本文采用單因素和正交試驗法，優(yōu)化了冬蟲夏草液體種子培養(yǎng)條件，探討了不同培養(yǎng)條件對冬蟲夏草細胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis.）：天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面種子培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)基（g/L）

土豆200 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、KH2PO43 g/L。

1.3 儀器與設(shè)備

梅特勒FiveGo便攜式pH計：瑞士梅特勒托利多；DGG型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津天宇機電有限公司；LD5-10型低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；YHG-Ⅱ迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司。

1.4 測定方法

1.4.1 生物量的測定

取20 mL搖瓶培養(yǎng)液，離心機4 000 r/min離心20 min，除去上清夜，水洗、再離心，重復(fù)3次。收集菌絲體，60℃烘干至恒重，在干燥器中冷卻到常溫，稱量。

1.4.2 pH的測定

用pH計測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 裝液量對冬蟲夏草細胞生長的影響

不同裝液量對冬蟲夏草細胞生長的影響如圖1所示。

圖1 不同裝液量對冬蟲夏草細胞生長的影響Fig.1 Effects of different medium volume in the flask on cell growth of Cordyceps sinensis

實驗結(jié)果表明裝液量對冬蟲夏草細胞生長有較大的影響，隨著裝液量的增加，生物量不斷增加，30%裝液量時獲得最大細胞干重，裝液量增加到40%時，獲得的菌體量下降，因此冬蟲夏草搖瓶培養(yǎng)采用30%裝液量。

2.2 培養(yǎng)溫度對冬蟲夏草細胞生長的影響

不同培養(yǎng)溫度對冬蟲夏草細胞生長的影響如圖2所示，實驗結(jié)果表明培養(yǎng)溫度對冬蟲夏草細胞生長有較大的影響，隨著溫度的升高，生物量不斷增加，但是在24℃后繼續(xù)升溫，生物量反而降低，因此確定24℃為冬蟲夏草最適培養(yǎng)溫度。

2.3 轉(zhuǎn)速對冬蟲夏草細胞生長的影響

不同轉(zhuǎn)速對冬蟲夏草細胞生長的影響如圖3所示。

圖2 不同培養(yǎng)溫度對冬蟲夏草細胞生長的影響Fig.2 Effects of different cultivation temperature on cell growth of Cordyceps sinensis

圖3 不同轉(zhuǎn)速對冬蟲夏草細胞生長的影響Fig.3 Effect of different rotation speed on cell growth of Cordyceps sinensis

從圖3中可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，生物量不斷增加，在轉(zhuǎn)速達到為200 r/min時獲得最大的菌體干重，這是因為隨著轉(zhuǎn)速的增加，培養(yǎng)液中的溶氧增加，生物量也增加，但150 r/min和200 r/min獲得細胞干重沒有明顯差別，主要是因為200 r/min時剪切力比較大，不利于冬蟲夏草細胞的生長，另外在200 r/min獲得菌絲體以大量的菌絲片段形式存在，而非菌絲球。所以綜上所述，采用150 r/min為最終的轉(zhuǎn)速。

2.4 正交試驗設(shè)計優(yōu)化冬蟲夏草培養(yǎng)條件[5]

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，擬定影響冬蟲夏草液體種子細胞生長的3個主要因素即A（培養(yǎng)溫度），B（搖床轉(zhuǎn)速）、C（裝液量）為優(yōu)選因素，每個因素3個水平進行L9（34）正交試驗，見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素水平Table 1The factors and levels of the L9（34）orthogonal experiments

2.4.1 試驗結(jié)果

以所得冬蟲夏草細胞干重為指標(biāo)，正交試驗結(jié)果及極差分析和方差分析見表2和表3。

表2 L9（34）正交試驗結(jié)果及極差分析Table 2The results of the L9（34）orthogonal experiments and theanalysis of range

表3 正交試驗的方差分析Table 3 The variance analysis of the orthogonal experiments

由正交試驗結(jié)果（表2）可知，第3號試驗（A1B3C3）獲得的菌體干重（10.09 g/L）最大，是9次試驗中最好的，因此，直接分析的最優(yōu)組合為A1B3C3。

通過極差分析（表2）可知，影響冬蟲夏草液體種子細胞生長各因素的主次順序為B、A、C，因此，可以確定最優(yōu)的水平組合為A2B3C2。方差分析（表3）表明：由于 F0.05

表4 驗證試驗結(jié)果Table 4 The results of verifying experiment

從表4中可知，當(dāng)培養(yǎng)條件為A1B3C3、A2B3C2、A2B3C3和A2B2C2時，獲得的菌體干重分別為9.74、10.19、10.56 g/L和10.45 g/L。結(jié)果表明組合A2B3C3和A2B2C2獲得的菌體干重大于其它兩種組合，但兩者沒有明顯差別，另外種子培養(yǎng)條件是否適合，除了要看獲得的菌體干重外，還要看菌絲球的形態(tài)。相對于組合A2B2C2，以A2B3C3為培養(yǎng)條件時，菌球在培養(yǎng)過程中逐漸松散，在培養(yǎng)后期菌絲以大量的菌絲片段形式存在，而非菌絲球，這可能是由于當(dāng)轉(zhuǎn)速比較高時，產(chǎn)生的剪切力也相應(yīng)比較大，菌絲球在培養(yǎng)過程中被剪切成很多碎片。所以從獲得的細胞干重和菌絲球形態(tài)考慮，確定冬蟲夏草液體培養(yǎng)條件的最優(yōu)組合為A2B2C2。

3 結(jié)論

通過單因素和正交試驗，確定冬蟲夏草液體種子最優(yōu)培養(yǎng)條件為A2B2C2：培養(yǎng)溫度24℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，裝液量30%（75 mL/250 mL）。在此條件下，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，獲得最大菌體干重為10.45 g/L。

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[1]汪玲玲.冬蟲夏草菌多糖發(fā)酵研究[D].廣州:華南農(nóng)業(yè)大學(xué),2003

[2]毛先兵.深層培養(yǎng)藥用蕈菌蛹蟲草生產(chǎn)蟲草素的研究[D].上海:華東理工大學(xué),2004

[3]康廷國.中藥鑒定學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2003:475-540

[4]王國棟.冬蟲夏草及人工蟲草菌絲防治腫瘤的研究概況[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,1999,6(6):14-15

[5]吳貴生.試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理[M].北京:冶金工業(yè)出版社,1997:46-67

Optimization of Cultivation Conditions for Inoculums of Cordyceps sinensis

YIN Hai-song1，2，QIN Shao-yan3，QIAO Chang-sheng2，JIA Shi-ru2
（1.Department of Biochemical Engineering，Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China；2.School of Bioengineering，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；3.Reach Sugical，Inc.，Tianjin 300457，China）

Abstract：At the submerged cultivation conditions in the shake flask， to optimize the cultivation conditions for Inoculums ofCordyceps sinensis，single factor and orthogonal array design were employed for investigating the effects of different cultivation conditions on cell growth ofCordyceps sinensis.The result indicated that the optimum cultivation conditions forCordyceps sinensiswere as follows：cultivation temperature 24 ℃，rotation speed 150 r/min， the medium volume in the flask 30%（75 mL/250 mL）.At the cultivation conditions， we get 10.45 g DW/L at the submerged cultivation in the shake flask.

Key words：Cordyceps sinensis；culture conditions；orthogonal array design；temperature；；rotation speed；the medium volume in the flask

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.031

殷海松（1980—），男（漢），碩士，講師，研究方向：發(fā)酵工程。

2013-04-09