黃豆脲酶的提取及其活性測(cè)定

林麗云，董曉潔，陳阿微

（韓山師范學(xué)院生物系，廣東潮州 521000）

黃豆脲酶的提取及其活性測(cè)定

林麗云，董曉潔，陳阿微

（韓山師范學(xué)院生物系，廣東潮州 521000）

摘 要：對(duì)市售黃豆進(jìn)行了脲酶提取研究，通過(guò)pH增值法對(duì)脲酶活性進(jìn)行測(cè)定，并確定黃豆脲酶的最佳提取方案。結(jié)果表明，提取黃豆脲酶的最佳方案為：采用干黃豆為原料，以30%乙醇溶液提取脲酶粗酶液，用分級(jí)沉淀的方法對(duì)粗酶液里的脲酶進(jìn)行分離，采用Sephadex G-150凝膠層析過(guò)濾裝置對(duì)脲酶液進(jìn)行純化，用真空冷凍干燥技術(shù)對(duì)脲酶液進(jìn)行干燥濃縮，得到酶活力最高的脲酶。

關(guān)鍵詞：黃豆；脲酶；分級(jí)醇沉；凝膠過(guò)濾；冷凍干燥

脲酶作為重要的生物制劑，廣泛分布于植物的種子中，但以黃豆、刀豆中含量豐富。黃豆中的脲酶，是一種寡聚酶，分子量約為293 500，等電點(diǎn)為3.9，具有絕對(duì)專一性，特異性地催化尿素水解釋放出氨和二氧化碳。

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)、科技的迅速發(fā)展，脲酶的需求量越來(lái)越大。但就目前來(lái)說(shuō)，脲酶在我國(guó)尚未形成自主的生產(chǎn)能力。商品化的脲酶產(chǎn)品主要由巨豆提取，而國(guó)內(nèi)又缺乏巨豆資源，對(duì)脲酶的迫切需求使我們不得不長(zhǎng)期依賴進(jìn)口。本實(shí)驗(yàn)以價(jià)格低廉、來(lái)源豐富的市售黃豆為原料提取脲酶；建立從黃豆中提取脲酶的全套流程，包括粗酶液的提取、脲酶的分級(jí)沉淀、分離純化，及酶液的干燥；對(duì)所提取的脲酶活性進(jìn)行檢測(cè)，為脲酶的分離、純化及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 主要原料

市售黃豆：購(gòu)買于潮州市韓山師范學(xué)院附近菜市場(chǎng)。

1.2 主要試劑

Sephadex-G150：西安樸天生物科技有限公司，BR；尿素：上海源葉生物科技有限公司，BR；無(wú)水乙醇、甘油和丙酮均為分析純?cè)噭?/p>

1.3 主要儀器

TGL-16R冷凍高速離心機(jī)：珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；pH-3c精密酸度計(jì)：上海紅益儀器儀表有限公司；交聯(lián)葡聚糖Sephadex G－150層析柱：上海精科；SBS-100數(shù)控記滴自動(dòng)部分收集器：上海康華生化儀器有限公司；LGJ-18冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司等。

2 方法

2.1 黃豆脲酶的提取

2.1.1 30%乙醇提取黃豆脲酶[1]

用天平稱取干燥的黃豆，粉碎，以100目鋼篩篩出豆粉。向錐形瓶中加入2.0g豆粉，再加入20mL的30%乙醇溶液，充分搖勻30 min，放置冰箱里保存24 h后，以3 000 r/min離心15 min，上清液為脲酶粗提取液。

2.1.2 70%甘油提取黃豆脲酶[2]

取25 g洗凈晾干的黃豆，用無(wú)氨蒸餾水浸泡過(guò)夜，轉(zhuǎn)入研缽中，加入少許70%甘油溶液研磨至糊狀，用70%甘油稀釋至250 mL，用玻璃棒攪拌混勻，靜置提取后減壓過(guò)濾，濾液盛于塑料瓶中，儲(chǔ)于冰箱中待用。

2.1.3 32%丙酮提取黃豆脲酶

稱取2 g黃豆粉置于三角瓶中，加入32%丙酮6 mL，振搖10 min，進(jìn)行提取，然后倒入離心管中，用32%丙酮2 mL洗小三角燒瓶一次，洗液也倒入離心管中，離心（3 000 r/min）5 min，將上清液倒入刻度離心管中量取體積，加入等體積的冷丙酮，使蛋白質(zhì)沉淀。進(jìn)一步離心（3 000 r/min）5 min，棄去上清液。待沉淀中的丙酮蒸發(fā)后，加蒸餾水2.5 mL，使沉淀溶解。如有沉淀，再離心（2 000 r/min）5 min，取上清液，即為脲酶粗提取液。

2.2 黃豆脲酶的分離純化

2.2.1 乙醇分級(jí)沉淀

向粗酶液中攪拌加入預(yù)冷（-10℃）的無(wú)水乙醇至終體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%和40%，再采用8 000 r/min冷凍離心10 min，收集上清液，測(cè)定酶活性。上清液繼續(xù)攪拌加入預(yù)冷乙醇至終體積分?jǐn)?shù)分別為40%和50%，15 000 r/min冷凍離心10 min，棄去上清液，收集沉淀，立即將沉淀溶于少量磷酸緩沖液（pH=6.8）中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 凝膠過(guò)濾

脲酶分子量較大，達(dá)293 500 u。脲酶粗制品通過(guò)交聯(lián)葡聚糖Senhadex G-150層析柱。酶本身不能進(jìn)入凝膠顆粒，而其他小分子物質(zhì)及分子量較小的蛋白質(zhì)可擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒。用磷酸緩沖液（pH=6.8）作為洗脫劑，分子量大的脲酶首先被洗脫下來(lái)，從而達(dá)到與其他物質(zhì)分離的目的。

稱取葡聚糖凝膠G—150 l g，置于三角燒瓶中，加水60 mL，于沸水浴中加熱5 h（此為加熱溶脹，如在室溫溶脹需放置48 h～72 h）取出，待冷卻至室溫裝柱。加樣，控制流速7 d/min～8 d/min，流出的液體分別收集在刻度離心管中，收集量為3 mL/管，測(cè)定各管蛋白質(zhì)含量，收集合并蛋白質(zhì)含量較高的各管并測(cè)其酶活，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 冷凍干燥

將經(jīng)凝膠過(guò)濾后的酶液分裝在玻璃皿，裝量要均勻，蒸發(fā)表面盡量大而厚度要盡量薄一些，產(chǎn)品厚度不要超過(guò)1 cm[3]。

將裝好的溶液速凍，溫度在-35℃左右，時(shí)間約2.0 h。凍結(jié)后的樣品須迅速進(jìn)行真空升華干燥,料溫控制在-20℃～-25℃之間，時(shí)間約為3 h～5 h。真空升華干燥后，樣品中仍含有少部分的結(jié)合水，較牢固，所以必須提高溫度，才能達(dá)到產(chǎn)品所要求的水分含量。控制料溫由-20℃升到55℃，當(dāng)料溫與板層溫度趨于一致時(shí)，結(jié)束干燥[4-5]。

真空干燥時(shí)間約為8 h～9 h，水分含量減至3%～5%左右，停止加熱，減壓，當(dāng)倉(cāng)內(nèi)真空度恢復(fù)接近大氣壓時(shí)打開倉(cāng)門，出倉(cāng)，將已干燥的樣品立即進(jìn)行活性測(cè)定。

3 pH增值法測(cè)定黃豆脲酶活性[6]

將研細(xì)的試樣與尿素緩沖液混合，尿素在尿素酶作用下水解產(chǎn)生氨，氨溶解于水溶液中使溶液pH升高，pH變化的程度與脲酶活性大小相關(guān)，因此可以用其與空白溶液的差值表示脲酶活性高低。

取0.200 g試樣，裝入比色管中，加入10 mL尿素緩沖液，迅速蓋上蓋子，劇烈搖動(dòng)。將比色管置于（30±0.5）°C的恒溫水浴鍋中，準(zhǔn)確保持30 min。另稱取等量試樣放入另一支比色管中，加入10 mL磷酸緩沖液，迅速蓋上蓋子，將試樣與緩沖液混合均勻，置于水浴鍋保持30 min，作為空白試驗(yàn)。每隔5 min將水浴鍋中比色管中的試樣搖勻一次。每個(gè)比色管保持30 min后，從水浴鍋中取出，將上清液倒入小燒杯中。并在從水浴鍋中取出恰好5 min時(shí)，用酸度計(jì)測(cè)出pH。

計(jì)算公式：UA=pH1-pH2

式中：UA為脲酶活性（ΔpH）；pH1為樣品使尿素分解后樣液的pH；pH2為空白樣液的pH。

4 結(jié)果與分析

4.1 提取方法及粗酶液的添加量不同對(duì)黃豆脲酶活性的影響

通過(guò)對(duì)3種方法提取的脲酶粗酶液活性進(jìn)行比較，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 不同的提取方法對(duì)脲酶液酶活性的影響Fig.1 Effect of different extraction methods on the enzyme activity of soybean urease

圖2 不同的添加量對(duì)脲酶酶活性的影響Fig.2 Effect of different addition amount on the enzyme activity of soybean urease

由圖1和圖2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：無(wú)論活性測(cè)定時(shí)添加的粗酶液量多或少，采用32%丙酮提取出的粗酶液活性始終最差；采用30%乙醇和70%甘油提取出的粗酶液活性較高；對(duì)活性測(cè)定時(shí)的粗酶液添加量從0.2 mL進(jìn)行至5倍、10倍的量的增加后，脲酶活性隨之增高，即脲酶活性與測(cè)定時(shí)粗酶液濃度成正比；另外，同等添加量的粗脲酶液以70%甘油提取出的脲酶活性略高于以30%乙醇提取的脲酶活性考，慮到二者數(shù)值相差甚微，而甘油提取的操作較繁瑣、所需試劑用量大，而乙醇提取則更為簡(jiǎn)便，故實(shí)驗(yàn)選用30%乙醇對(duì)黃豆脲酶進(jìn)行提取。

4.2 乙醇分級(jí)沉淀過(guò)程中，不同終體積分?jǐn)?shù)對(duì)脲酶活性的影響

4.2.1 黃豆粗酶液經(jīng)一級(jí)沉淀（8 000 r/min）后，不同終體積分?jǐn)?shù)的酶液活性

一級(jí)沉淀（8 000 r/min）后不同終體積分?jǐn)?shù)的脲酶酶液活性，結(jié)果見圖3。

圖3 一級(jí)沉淀（8 000 r/min）后不同終體積分?jǐn)?shù)的脲酶酶液Fig.3 Enzyme activity of soybean urease for different terminal volume after first-degree precipitation（8 000 r/min)

由圖3可知，當(dāng)加入預(yù)冷乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，收集到的上清液酶活性達(dá)到最高。當(dāng)終體積分?jǐn)?shù)到達(dá)40%時(shí)，隨著酶被沉淀下來(lái)，上清液中酶活降低。故從以上四個(gè)體積分?jǐn)?shù)梯度來(lái)看，冷凍乙醇一級(jí)沉淀終體積分?jǐn)?shù)選擇在10%時(shí)收集到的上清液酶活性最佳。

4.2.2 黃豆酶液經(jīng)二級(jí)沉淀（15 000 r/min）后，不同終體積分?jǐn)?shù)的酶液活性

二級(jí)沉淀（15 000 r/min）后不同終體積分?jǐn)?shù)酶液活性對(duì)比結(jié)果見圖4。

圖4 二級(jí)沉淀（15 000 r/min）后不同終體積分?jǐn)?shù)的脲酶酶液活性Fig.4 The enzyme activity of soybean urease for different terminal volume after second-degree precipitation（15 000 r/min）

由圖4可知，經(jīng)二級(jí)沉淀（15000r/min）后，終體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)的酶液活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于終體積分?jǐn)?shù)為50%的酶液酶活。即終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí)沉淀中殘留的酶很少，基本為0，故其酶活性很低。所以在冷凍乙醇的二級(jí)沉淀過(guò)程中，應(yīng)使終體積分?jǐn)?shù)為40%，以保留較多的酶。

4.3 黃豆脲酶在分級(jí)沉淀過(guò)程中的活性變化

大豆脲酶在各階段酶液活性對(duì)比結(jié)果見圖5。

圖5 大豆脲酶在提取各階段的酶液活性Fig.5 The enzyme activity of soybean urease at different extraction stages

由圖5可看出，黃豆經(jīng)30%乙醇溶液提取后得到的粗酶液活性在分級(jí)沉淀過(guò)程中最高。經(jīng)過(guò)3 000 r/min離心15 min后的粗酶液中還殘留有較多的豆殼、豆渣，而這些殘留物中或多或少存在著部分脲酶，因此所測(cè)出的粗酶液活性也就相應(yīng)的高，但雜質(zhì)含量也高；經(jīng)一級(jí)沉淀（8 000 r/min）后，黃豆酶液活性大大降低?？赡苁怯捎诮?jīng)過(guò)離心，此時(shí)上清液中的豆渣殘留量大幅減少，同時(shí)加入的冷凍乙醇稀釋了酶液的濃度，故測(cè)出的上清液酶活性偏低；經(jīng)過(guò)二級(jí)沉淀（15 000 r/min）后，黃豆酶液活性比一級(jí)沉淀的略高。因?yàn)榇藭r(shí)收集到的沉淀中脲酶的含量較高，且除去上清液后冷凍乙醇對(duì)酶活的影響甚微；雖然收集的脲酶沉淀中溶入了少量的磷酸緩沖液（pH=6.8），但因其量少對(duì)酶液濃度影響不大。

黃豆脲酶經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠G-150過(guò)濾后，活性再次降低，約為0.12。造成該過(guò)程酶活偏低的原因可能是此階段需加入大量磷酸緩沖液（pH=6.8）進(jìn)行洗脫，因此所收集酶液中摻雜了大量的磷酸緩沖液，從而稀釋了脲酶的濃度，故所測(cè)出的活性偏低。

經(jīng)過(guò)冷凍干燥后，酶液中的磷酸緩沖液等水分得以去除，脲酶得到濃縮，純度進(jìn)一步提高，干黃豆脲酶的活性得到增加。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)主要研究不同方法提取黃豆脲酶，并對(duì)所提取的脲酶進(jìn)行分離純化，同時(shí)測(cè)定其活性，以確定脲酶的最佳提取、分離、純化方法。實(shí)驗(yàn)利用不同溶劑從干鮮黃豆中提取出黃豆脲酶，對(duì)脲酶的酶活進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，從操作的簡(jiǎn)便性和所提取出酶液的活性等綜合方面考慮，用30%乙醇溶液作為提取劑，要優(yōu)于70%甘油和32%丙酮溶液。脲酶粗酶液加預(yù)冷乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為10%，以8 000 r/min冷凍離心10 min進(jìn)行一級(jí)沉淀；再將上清液加預(yù)冷乙醇至終體積分?jǐn)?shù)40%，15 000 r/min冷凍離心10 min進(jìn)行二級(jí)沉淀；收集脲酶沉淀進(jìn)行G－150凝膠過(guò)濾；最后將經(jīng)過(guò)洗脫收集到的酶液進(jìn)行冷凍干燥，即得到較純且活性相對(duì)較高的脲酶。

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Study on the Extraction and Enzyme Activity Determination of Urease from Soybean

LIN Li-yun，DONG Xiao-jie，CHEN A-wei
（Biology Department，Hanshan Normal University， Chaozhou 521000，Guangdong，China）

Abstract：Method of extraction and activity determination for the urease from soybean was investigated and the best method to gain highest activity urease was proposed as follows：dry soybean was extracted by 30%alcohol.The urease solution was separated by Sephadex G-150 column chromatography and concentrated by vacuum freezing dry.

Key words：soybean；urease；ethanol fractional precipitation；gel filtration；freeze dry

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.09.023

韓山師范學(xué)院青年基金項(xiàng)目（LQ200811）

林麗云（1982—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事生物資源高值利用。

2012-10-08