趙云玲，龔小見(jiàn)，周欣，*，陳華國(guó)，趙超

（1.貴州師范大學(xué)天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴州貴陽(yáng) 550001；2.貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550001）

芹菜（Apium graveolens L.）屬傘形花科一年或兩年生草本植物，有西芹、旱芹等品種。芹菜不僅具有食用價(jià)值，而且是一種“藥食同源”的綠色天然產(chǎn)物。傳統(tǒng)醫(yī)藥認(rèn)為，芹菜有“甘涼清胃、滌熱祛風(fēng)、補(bǔ)血健脾、止咳利尿、降壓鎮(zhèn)靜、利口齒咽喉、養(yǎng)精益氣、明目”等功用[1]。芹菜中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物，具有降壓安神、降血脂、保護(hù)血管和增強(qiáng)免疫力的功能。醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)物質(zhì)是對(duì)人體具有生理活性的一類(lèi)物質(zhì)，曾被稱(chēng)為維生素P[2]，具有抗氧化、抗衰老[3]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、防癌抑癌等功能，提取和測(cè)定芹菜內(nèi)的黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)更有效地開(kāi)發(fā)利用該藥用植物資源能起到一定的指導(dǎo)作用[4]。文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取方法主要有超聲法、溫浸法、回流法、超臨界CO2萃取法以及微波輔助萃取法[3-6]。本論文對(duì)芹菜中黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行了提取工藝的研究，旨在為芹菜的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供基礎(chǔ)科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（Cary-100型）：美國(guó)瓦里安公司；石英比色皿（1 cm）；電子天平（AL 204型）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK–98-Ⅱ型）：天津市泰斯特儀器有限公司；真空干燥箱（DF-6020）：杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠；超聲儀（KQ 5200E型）：昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.2 試劑

芹菜購(gòu)買(mǎi)于貴陽(yáng)市煤礦村蔬菜市場(chǎng)，經(jīng)天然藥物質(zhì)量控制研究中心陳華國(guó)老師鑒定；蘆丁對(duì)照品：貴州迪大；其余試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮的提取與測(cè)定

芹菜清洗去雜后，晾干粉碎，精密稱(chēng)取芹菜粗粉2.00 g，置250 mL錐形瓶中，加入一定量，一定濃度的乙醇溶液，在一定溫度下以一定的方式提取，冷卻，過(guò)濾，濾液于50℃水浴中蒸發(fā)濃縮至呈黏稠膏狀，移至真空干燥箱內(nèi)50℃干燥2 h，取出，冷卻至室溫，稱(chēng)重，得浸膏質(zhì)量。

浸膏用甲醇溶解，于25 mL容量瓶中定容，室溫下超聲處理5 min，使之盡可能溶解。之后移取上清液2 mL于25 mL容量瓶中，加入甲醇至12 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，置5 min；加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，置5 min；加入4%NaOH溶液10 mL，定容至刻度，搖勻置15 min，于510 nm波長(zhǎng)測(cè)定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱(chēng)取120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20 mg于100 mL容量瓶中，甲醇定容，得0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

分別量取 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于25 mL容量瓶中，加入甲醇至12 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL置5 min，加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，置5 min，加入4%NaOH溶液10 mL，定容至刻度，搖勻置15 min，標(biāo)準(zhǔn)系列濃度依次為0.008、0.016、0.024、0.032、0.040 mg/mL。同法做試劑空白。

以空白溶液作參比，于510 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，以吸光度對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程y=19.738x-0.005 7，R2=0.999 2，表明吸光度與蘆丁濃度呈良好的線性關(guān)系。

1.2.3 方法學(xué)考察

分別研究不同溶劑濃度、提取溫度、提取時(shí)間、提取方式、料液比對(duì)芹菜總黃酮提取率的影響。

1.2.4 總黃酮提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化芹菜中總黃酮提取的工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑濃度考察

精密稱(chēng)取2.000g芹菜粉末5份，分別用20%、40%、60%、80%、100% 的乙醇溶液以 1∶50（g：mL）的料液比加入錐形瓶中，混勻，85℃水浴加熱回流提取總黃酮，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)提取工藝的影響Fig.1 Effects of ethanol concentrations on extracting process

由圖1可見(jiàn)，乙醇濃度以40%為最佳，這可能是因?yàn)榍鄄酥悬S酮為多種化合物的混合物，包括各種黃酮苷和苷元，這些物質(zhì)由于極性和化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，在不同極性的提取溶劑中的溶解度也不盡相同。試驗(yàn)表明，體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液相對(duì)于其它濃度能更好地提取出芹菜中的黃酮類(lèi)化合物。

2.2 提取方式考察

2.2.1 回流法

精密稱(chēng)取2.00 g芹菜粉末，以40%乙醇為溶劑，料液比 1∶50（g∶mL），85 ℃ 水浴回流提取總黃酮。

2.2.2 超聲法

精密稱(chēng)取2.00 g芹菜粉末，以40%乙醇為溶劑，料液比 1∶50（g∶mL），功率 200 W，時(shí)間 25 min，60 ℃ 超聲提取。

2.2.3 溫浸法

精密稱(chēng)取2.00 g芹菜粉末，以40%乙醇為溶劑，料液比 1∶50（g∶mL），45 ℃ 恒溫浸提總黃酮見(jiàn)圖 2。

圖2 不同提取方式對(duì)提取工藝的影響Fig.2 Effect of different extracting methods on extracting process

不同提取方式對(duì)芹菜中總黃酮的提取工藝也有影響，在回流、溫浸、超聲三種方式中，以回流效果較佳。這可能是由于部分黃酮類(lèi)物質(zhì)在超聲過(guò)程中結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致超聲效果較差，而溫浸法則可能由于黃酮類(lèi)物質(zhì)在此過(guò)程中未被溶出，因此提取效果不佳。

2.3 提取溫度考察

精密稱(chēng)取2.00 g芹菜粉末5份，以40%乙醇為溶劑，分別在 55、65、75、85、95℃ 條件下回流提取總黃酮，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)提取工藝的影響Fig.3 Effects of extracting temperatures on extracting process

由圖3表明：溫度不同，提取的總黃酮的含量不同。在65℃和85℃時(shí)總黃酮的提取率相差無(wú)幾，綜合考慮溫度太高可能使黃酮發(fā)生氧化，且雜質(zhì)溶出較多，并增加能耗等因素，因此選最佳提取溫度為65℃。

2.4 料液比考察

精密稱(chēng)取2.00 g芹菜粉末，以40%乙醇為溶劑，固液比分別為 1∶8（g∶mL），1∶10（g∶mL），1∶12（g∶mL），1∶15（g∶mL），1∶18（g∶mL），并于 65 ℃ 回流提取，結(jié)果如圖4。

圖4 料液比對(duì)提取工藝的影響Fig.4 Effects of solid liquid ratios on extracting process

從圖4中可看出隨著固液比的降低，提取的總黃酮含量隨之增大，但當(dāng)固液比達(dá)到 1∶15（g∶mL）后，黃酮的提取率增加不明顯，考慮到提取劑用量和提取液蒸發(fā)濃縮時(shí)的能源消耗，固液比以1∶15（g∶mL）為宜。

2.5 提取時(shí)間考察

精密稱(chēng)取2.00 g芹菜粉末，以40%乙醇為溶劑，料液比為 1 ∶15（g∶mL），于 65 ℃回流提取，時(shí)間分別為0.5、1、2 、3 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)提取工藝的影響Fig.5 Effects of extracting time on extracting process

從圖5可以看出，提取時(shí)間為1 h時(shí)提取效果比較理想，耗時(shí)短且提取率高，能較好的應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，因此考慮最佳提取時(shí)間為1 h。

2.6 總黃酮提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

為全面考察影響因素，基于單因素試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)影響提取效果的主要因素設(shè)計(jì)了三因素三水平的正交試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2（其中D項(xiàng)為空白列），方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal test

表2L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Results for the orthogonal text L9（34）

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of analysis of variance

由表2和表3可以看出，各因素對(duì)黃酮提取率均有顯著性影響，依次為料液比＞回流時(shí)間＞提取次數(shù)，綜合考慮，確定最佳工藝條件為A3B2C3。即以料液1 ∶18（g∶mL），每次 1 h，提取 3 次提取效果最佳。

2.7 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證

由于優(yōu)選的工藝未包含在正交設(shè)計(jì)表的9次試驗(yàn)中，故對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 優(yōu)化工藝條件的驗(yàn)證結(jié)果Table 4 Results for the text of optimum process

用同一批藥材，按條件A3B2C3進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，總黃酮含量穩(wěn)定在3.5左右，RSD為0.19%，表明此優(yōu)化工藝穩(wěn)定、可行。

正交試驗(yàn)中部分試驗(yàn)測(cè)定的總黃酮的含量高于驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，但是差異不大，考慮到實(shí)際生產(chǎn)中時(shí)間寶貴、節(jié)約成本的問(wèn)題，還是以正交試驗(yàn)優(yōu)選的工藝條件為準(zhǔn)。

3 討論

3.1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

為檢驗(yàn)測(cè)定方法的準(zhǔn)確性，對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，準(zhǔn)確移取“1.2.1”項(xiàng)下的上清液1.0 mL 9份，分別加入濃度為0.0078 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、2.0、2.5 mL各3份，定容顯色測(cè)定吸光度，結(jié)果表明，加入3種不同含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品加標(biāo)回收率均在97%以上，回收率RSD為1.5%，說(shuō)明試驗(yàn)方法是可行的。

3.2 精密度試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)濃度為0.060 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6次測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.7%，表明儀器精密度良好。

表5 樣品加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果Table 5 Results for the text of recovery

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

稱(chēng)取同一批次芹菜粉末，按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備4份，并進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算芹菜中總黃酮含量。結(jié)果R.S.D.為2.07%，表明方法重現(xiàn)性良好。

4 結(jié)論

黃酮類(lèi)化合物的提取，文獻(xiàn)報(bào)道大多為溶劑萃取法、超聲法、微波法、堿提酸沉法、碳吸附法提取、超臨界CO2流體萃取法，結(jié)合黃酮類(lèi)物質(zhì)為親水性有機(jī)溶劑，本實(shí)驗(yàn)以乙醇為溶劑考察了超聲法、溫浸法、熱回流法等提取方式，同時(shí)對(duì)乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間做了單因素考察，又設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)綜合考察了料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)，又做了驗(yàn)證性試驗(yàn)、加標(biāo)回收率試驗(yàn)，考察了精密度、重現(xiàn)性，從而確定芹菜中總黃酮的最佳提取工藝：乙醇濃度為40%，溫度為 65℃，料液比為 1∶18（g∶mL），熱回流提取 3次，每次1 h。

這一最佳提取工藝的獲得對(duì)提高芹菜中總黃酮的提取率具有一定的參考價(jià)值，為芹菜的綜合開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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