微波輔助超聲提取南瓜多糖及其抗氧化性研究

丁宏偉，李志香，蔡云飛

（齊魯師范學(xué)院生物系，山東濟(jì)南 250013）

南瓜是葫蘆科植物南瓜的果實(shí)，具有生長(zhǎng)強(qiáng)健，對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量大、抗病蟲(chóng)害能力強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)全面等特點(diǎn)，一般不需使用農(nóng)藥，少有污染，因此在我國(guó)南北方廣為種植。南瓜的果肉富含多種氨基酸、維生素、多糖、果膠、礦物質(zhì)，還含有類(lèi)胡蘿卜素等多種生物活性物質(zhì)。南瓜多糖是其活性成分中最重要、最具潛力功能因子之一[2]，并對(duì)糖尿病癥狀有顯著的治療效果[3]。因此，對(duì)南瓜進(jìn)行深加工，提取其南瓜多糖有著重要的經(jīng)濟(jì)效益。

目前，南瓜多糖常用的提取方法一般為熱水浸提法，但此方法效率低，操作時(shí)間長(zhǎng)。很多學(xué)者致力于尋找高效、快速、簡(jiǎn)易的南瓜多糖提取方法。本研究采用微波輔助超聲波提取南瓜多糖，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用正交試驗(yàn)研究了微波處理時(shí)間、超聲波處理時(shí)間及超聲處理溫度對(duì)多糖提取率的影響，優(yōu)化了提取工藝，同時(shí)研究了提取的多糖的抗氧化性質(zhì)，為今后南瓜的加工工藝及抗氧化活性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市售潔凈、成熟南瓜；苯酚，葡萄糖，硫酸，無(wú)水乙醇，水楊酸，濃鹽酸，過(guò)氧化氫，蒽酮，七水硫酸亞鐵，鄰苯三酚，1，1－二苯基－2－三硝基苯肼等，化學(xué)試劑均為分析純；722s型分光光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；752pc紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；101－3－s電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；DS－1高速組織搗碎機(jī)：上海精密儀器儀表有限公司；CR20BZ型高速離心機(jī)：日立公司；81－2型恒溫磁力攪拌器：上海司樂(lè)儀器有限公司；超聲波清洗儀KQ100DB（超聲頻率40 kHz，超聲功率100 W）：上海越眾儀器設(shè)備有限公司；格蘭仕微波爐G80F20CSLB8（S0）（微波頻率 2450 MHz，功率 800 W）：格蘭仕；電子恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 南瓜多糖的熱水浸提法[4]

將南瓜洗凈切塊，打漿，稱(chēng)取100 g，按料液比1∶4（g/mL）加入蒸餾水，置于 75℃～85℃水浴中 6 h，過(guò)濾收集濾液，慮渣再次加入1倍南瓜的水，相同溫度提取6 h，過(guò)濾收集濾液，將兩次所得抽提液混合濃縮。濃縮液經(jīng)脫脂、脫蛋白和脫色后，于離心機(jī)中以4 000 r/min離心20 min，去除沉淀，將上清液與95%乙醇作用，靜置2 h，于4 000 r/min離心20 min，將沉淀相繼用丙酮、乙醚洗滌，真空干燥，即得多糖樣品，測(cè)定其多糖含量。

1.2.2 南瓜多糖含量測(cè)定[5]

總糖含量采用蒽酮－硫酸法測(cè)定；還原糖含量采用3，5－二硝基水楊酸比色法（以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品）。多糖含量＝總糖－還原糖含量。多糖提取率＝c×100%/m。式中：c為多糖含量；m為提取所用南瓜的質(zhì)量。

1.2.3 南瓜多糖抗氧化性測(cè)定

1.2.3.1 清除羥基自由基（·OH）能力的測(cè)定[6]

反應(yīng)體系中加入2 mL濃度為9 mmol/L的硫酸亞鐵，2mL濃度為9mmol/L的水楊酸－乙醇混合液和不同濃度的樣品3mL，2mL濃度為8.8mmol/L的過(guò)氧化氫，不同濃度的多糖樣品3mL，啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)1h，以蒸餾水為參比，在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)量各試樣的吸光度，以2 mL的9 mmol/L硫酸亞鐵，2 mL的9 mmol/L水楊酸－乙醇和2 mL蒸餾水為待測(cè)溶液的本底吸光度。

羥基自由基清除率＝[A0－（Ax-Ax0）/A0]×100%

式中：A0為對(duì)照，不加南瓜多糖，Ax為某濃度時(shí)的吸光值，Ax0為無(wú)顯色劑時(shí)的該濃度的本底值。

1.2.3.2 清除超氧陰離子自由基（O2－·）能力的測(cè)定[7]

取 0.05 mol/L pH 8.2的 Tris－HCl緩沖液 4.5 mL，置于25℃水浴中預(yù)熱，分別加入0.1 mL不同濃度的南瓜多糖樣品液和0.4 mL濃度為25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，反應(yīng)4 min，加入濃度8 mol/L濃鹽酸終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)290 nm下測(cè)定吸光度（Ai），空白組以同等體積的蒸餾水代替樣品液，吸光度A0。

超氧陰離子自由基清除率＝[（Ai－A0）/A0]×100%。

1.2.3.3 DPPH自由基清除作用的測(cè)定[8]

取不同濃度的糖溶液1.5 mL，加入0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液3 mL，混勻后25℃靜置20 min后在517 nm處測(cè)吸光度值。以蒸餾水代替樣品作為空白，以酒精溶液代替DPPH－乙醇溶液作為對(duì)照。

DPPH自由基清除率＝[1－（Asample－Acontrol）/Ablank]×100%

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取料液比為1∶4（g/mL）的南瓜漿液，經(jīng)微波爐處理 1、2、3、4、5 min 后，過(guò)濾收集濾液，慮渣再次加入 1倍南瓜的水，75℃～85℃水浴中提取2 h，按上述步驟處理后測(cè)定多糖含量，確定微波處理時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響；將1∶4（g/mL）的南瓜漿液置于超聲波清洗儀中（室溫）處理 5、10、15、20、25、30 min，過(guò)濾收集濾液，按上述步驟處理后測(cè)定多糖含量，確定超聲處理時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響；分別將1∶4（g/mL）的南瓜漿液經(jīng) 30、40、50、60、70、80 ℃的超聲波處理 5 min，過(guò)濾收集濾液，按上述步驟處理后測(cè)定多糖含量，確定超聲處理溫度對(duì)多糖提取率的影響。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)微波處理時(shí)間、超聲波處理時(shí)間及溫度3個(gè)因素分別選擇3個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳的處理?xiàng)l件。將最佳處理?xiàng)l件下提取的南瓜多糖配制成 1、2、3、4、5 mg/mL濃度，測(cè)定其抗氧化性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 微波處理時(shí)間對(duì)南瓜多糖提取率的影響

實(shí)驗(yàn)前測(cè)得傳統(tǒng)熱水浸提法（料液比1∶4，提取溫度75℃～85℃，提取時(shí)間12 h）對(duì)南瓜多糖的提取率為2.02%，將南瓜漿液經(jīng)微波爐分別處理1、2、3、4、5 min后，過(guò)濾收集濾液，濾渣再次加入1倍南瓜的水，75℃～85℃水浴中提取2 h，處理后測(cè)定多糖含量，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，由于微波處理后熱水浸提時(shí)間比傳統(tǒng)法短，因此在微波處理1 min～2 min時(shí)，多糖的得率較傳統(tǒng)長(zhǎng)時(shí)間熱水浸提法的得率少，當(dāng)超聲時(shí)間2 min以上時(shí)，微波結(jié)合短時(shí)間熱水浸提法的效果較傳統(tǒng)浸提法明顯提高，在微波處理時(shí)間3 min～4 min時(shí)，多糖得率變化緩慢，當(dāng)微波處理時(shí)間超過(guò)4 min，多糖得率開(kāi)始緩慢下降，可能是由于微波處理對(duì)南瓜多糖起到了破壞作用。因此，微波處理時(shí)間以不超過(guò)4 min為好。

圖1 微波處理時(shí)間與多糖得率的關(guān)系Fig.1 Relation between microwave treatment time and extraction rate of pumpkin polysaccharide

2.1.2 超聲波處理時(shí)間對(duì)南瓜多糖提取率的影響

將1∶4（g/mL）的南瓜漿液置于超聲波清洗儀中（室溫）處理 5、10、15、20、25、30 min，過(guò)濾收集濾液，處理后測(cè)定多糖含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 超聲處理時(shí)間與多糖得率的關(guān)系Fig.2 Relation bebtween ultrasonic wave treatment time and extraction rate of pumpkin polysaccharide

從圖2可以看出，隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，南瓜多糖得率增大。在超聲處理25 min以下時(shí)，南瓜多糖得率增加迅速，當(dāng)超聲處理25 min時(shí)，多糖得率達(dá)到2.83%，比傳統(tǒng)熱浸法提高41%，效果明顯，當(dāng)超聲處理超過(guò)25 min時(shí)，多糖得率變化緩慢，因此，超聲處理以不超過(guò)30 min為宜。

2.1.3 超聲處理時(shí)的溫度對(duì)南瓜多糖提取率的影響

分別將 1 ∶4（g/mL）的南瓜漿液經(jīng) 30、40、50、60、70、80℃的超聲波處理5 min，過(guò)濾收集濾液，處理后測(cè)定多糖含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 超聲處理溫度與多糖得率的關(guān)系Fig.2 Relation bebtween ultrasonic wave treatment temperature and extraction rate of pumpkin polysaccharide

從圖3可以看出，南瓜多糖提取率隨著超聲處理溫度的提高而增大，在70℃以下，隨著溫度的升高，多糖得率顯著提高，溫度高于70℃時(shí)，超聲處理溫度對(duì)多糖得率影響很小，而溫度過(guò)高一方面能耗大，另一方面可能導(dǎo)致多糖降解，因此，超聲處理溫度以不超過(guò)80℃為宜。

2.2 正交試驗(yàn)分析

為了研究各因素的重要程度，確定3個(gè)因素同時(shí)作用時(shí)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有無(wú)協(xié)同作用，確定出最大的南瓜多糖提取率，分別對(duì)微波處理時(shí)間、超聲處理時(shí)間及溫度取合理的3個(gè)水平，以多糖得率為指標(biāo)，按正交試驗(yàn)表L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)。確定最佳的處理?xiàng)l件組合。

2.2.1 因素水平表

因素水平表，見(jiàn)表1。

表1 因素水平表Table 1 Factor horizontal table

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果分析，見(jiàn)表2。

由極差分析表可見(jiàn)，在這3個(gè)試驗(yàn)因素中，超聲處理時(shí)間是最主要的影響因素，南瓜多糖提取率隨超聲處理時(shí)間延長(zhǎng)而增大；其次是微波處理時(shí)間在3 min時(shí)最好，高于或低于該時(shí)間效果都較差；最后為超聲處理溫度，溫度越高，提取率越高。最優(yōu)的處理?xiàng)l件為A3B2C3，即超聲處理30 min，微波處理3 min，超聲處理溫度70℃時(shí)南瓜多糖的提取率最大。

由方差分析表3可知，本試驗(yàn)的三個(gè)因素中，超聲處理時(shí)間對(duì)南瓜提取率的影響最大，其次是微波處理時(shí)間，超聲溫度的影響最小。由于最優(yōu)組合并未出現(xiàn)在正交表中，因此，對(duì)最優(yōu)組合A3B2C3進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定南瓜多糖的提取率，計(jì)算平均值，此時(shí)提取率可達(dá)3.65%，比傳統(tǒng)熱浸提法效率提高了80%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析表Table 2 Experiment results and range analysis

表3 方差分析表Table 3 Table of variance analysis

2.3 南瓜多糖的抗氧化作用

羥基自由基被認(rèn)為是毒性最強(qiáng)的活性氧自由基，比高錳酸鉀和重鉻酸鉀氧化性還強(qiáng)，對(duì)機(jī)體的破壞作用最大[9]。超氧陰離子自由基（O2·）在氧化反應(yīng)中扮演著非常重要的角色，因?yàn)樵诜磻?yīng)順序上其他許多活性中間產(chǎn)物的形成都始于與O2·的作用。DPPH自由基是一種比較穩(wěn)定的自由基，與其他自由基評(píng)價(jià)抗氧化性的方法比較，DPPH自由基能快速的反應(yīng)樣品的抗氧化活性[10]?？箟难峋哂袕?qiáng)的還原性，在食品中被廣泛作為抗氧化劑使用，能夠顯著地清除羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。不同濃度南瓜多糖清除自由基的能力見(jiàn)表4。

由表4可見(jiàn)，不同濃度南瓜多糖，均對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基具有一定的清除作用。但效果均低于抗壞血酸。在南瓜多糖濃度為4 mg/mL以下時(shí)，南瓜多糖對(duì)各種自由的清除作用相對(duì)較弱，當(dāng)濃度大于4 mg/mL時(shí)，對(duì)各種自由的清除作用明顯提高，并且隨著南瓜多糖濃度的提高，清除自由基的效果越明顯。

表4 不同濃度南瓜多糖對(duì)自由基的清除作用Table 4 The scavenging effect of different density of pumpkin polysaccharide on free radical

3 結(jié)果與討論

研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)廣為種植的南瓜不但營(yíng)養(yǎng)豐富，而且具有保健和防病治病的功效，其中的南瓜多糖是其活性成分中最重要的功能因子，因此，對(duì)南瓜多糖的提取及其抗氧化性的研究有著重要的經(jīng)濟(jì)效益。超聲及微波處理可將南瓜細(xì)胞壁粉碎，有利于多糖的溶出，南瓜多糖的溶出速度與超聲處理時(shí)間、微波處理時(shí)間及超聲處理溫度有關(guān)。隨著超聲處理時(shí)間和微波處理時(shí)間的增加，多糖提取率增大。提高超聲處理溫度可以提高南瓜多糖的溶出速度，但效果不明顯。

采用微波輔助超聲波處理可以很大程度的提高南瓜多糖的提取率。其中，超聲處理時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響最為顯著，其次是微波處理時(shí)間，超聲處理溫度有一定程度的影響。通過(guò)正交試驗(yàn)確定出最佳的處理方法，即微波時(shí)間3 min，超聲處理時(shí)間30 min，超聲溫度70℃時(shí)效果最好，南瓜多糖的提取率為3.65%，與傳統(tǒng)長(zhǎng)時(shí)間熱水浸提法相比，提高效率80%，同時(shí)提取時(shí)間可以大大縮短。將最佳處理?xiàng)l件下提取的南瓜多糖進(jìn)行抗氧化性研究，結(jié)果表明，不同濃度的南瓜多糖對(duì)自由基均有清除作用，但比抗壞血酸的抗氧化性低。在低濃度時(shí)，南瓜多糖清除自由基的作用相對(duì)較小，當(dāng)多糖濃度大于4 mg/mL時(shí)，對(duì)自由基的清除作用十分顯著。

微波輔助超聲處理可以粉碎南瓜細(xì)胞壁，從而釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，但是南瓜多糖的溶解過(guò)程比較復(fù)雜，微波及超聲波對(duì)細(xì)胞壁的作用機(jī)理還不是十分清除。例如南瓜多糖如何溶出，釋放的南瓜多糖的性質(zhì)是否發(fā)生了變化等還有待于進(jìn)一步的研究和討論。采用本文所提供的方法提取南瓜多糖收率高，且能較好的保持其生理活性。對(duì)于提取的南瓜多糖的抗氧化性研究還可以在本研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增加體內(nèi)試驗(yàn)，從而進(jìn)一步了解南瓜多糖的生理活性。

該研究為南瓜多糖的大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)提供科學(xué)參考。當(dāng)然目前的微波和超聲設(shè)備由于其自身設(shè)計(jì)的局限性，不適宜在工業(yè)中的大規(guī)模應(yīng)用，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)需要對(duì)設(shè)備進(jìn)行改造，從而實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。當(dāng)然，如何實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還存在很多問(wèn)題，有待于進(jìn)一步的研究和討論。

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