趙文越，王雪青，何曉萍

（天津市食品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

螺旋藻[1-2]是地球上最古老的原核光合生物，迄今已有35億年的生命史，是目前發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)最豐富、最均衡的天然綠色食品，有“微型綠色營養(yǎng)庫”之稱。然而，螺旋藻是一種淡水藻，需要大量的淡水對其培養(yǎng)，而日益短缺的淡水資源限制其生產(chǎn)規(guī)模。

利用廢水養(yǎng)殖螺旋藻不僅降低其生產(chǎn)成本，更重要的是對環(huán)境友好。20世紀(jì)70年代以來，國外就有利用沼氣池廢水、城市廢水、二級(jí)處理廠廢水以及繅絲、印染、制藥、釀造、制糖、制革等工業(yè)有機(jī)廢水養(yǎng)殖螺旋藻等微藻并使廢水得以凈化的報(bào)道[3-6]。國內(nèi)也有關(guān)于利用糖蜜、酒精、啤酒廢液對螺旋藻實(shí)施培養(yǎng)的研究。廢水來源不同，重金屬等有毒物質(zhì)的含量也不同。生產(chǎn)食品級(jí)螺旋藻只能采用無毒或低毒廢水，而對于飼料或工業(yè)級(jí)螺旋藻可適當(dāng)放寬要。

近年純凈水產(chǎn)量急劇上升，伴其而生的廢水也急劇增加。這些廢水倒入河流，不僅造成浪費(fèi)，而且改變河流的鹽度，影響環(huán)境。純凈水生產(chǎn)廢水含有一定量的無機(jī)物（C、N、P源）和各種金屬離子，這些無機(jī)物為螺旋藻的生長提供基本營養(yǎng)條件。經(jīng)過適當(dāng)調(diào)節(jié)，就能利用這些廢水生產(chǎn)高價(jià)值的螺旋藻。

研究不同營養(yǎng)條件下，利用純凈水生產(chǎn)廢水培養(yǎng)螺旋藻，旨在為利用純凈水生產(chǎn)廢水培養(yǎng)螺旋藻提供有益的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種

鈍頂螺旋藻869藻株:天津商業(yè)大學(xué)生物工程專業(yè)實(shí)驗(yàn)室獲得。

1.1.2 廢水

純凈水的生產(chǎn)廢水：天津商業(yè)大學(xué)品佳水中心提供。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

DDSJ-308A型臺(tái)式電導(dǎo)率儀、7230G型分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；FD-2型密封式恒溫可調(diào)電加熱器：金壇市瑞華儀器有限公司；SN510C型高壓蒸汽滅菌鍋：重慶雅馬拓科技有限公司；HPG-280BX光照培養(yǎng)箱：北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司；DG-202-3型電熱恒溫干燥箱：天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 測定方法

1.3.1 pH的測定

精密pH試紙法。

1.3.2 電導(dǎo)率的測定

電導(dǎo)率儀法。

1.3.3 藻的培養(yǎng)與生物量的測定

取一瓶對數(shù)生長期的鈍頂螺旋藻培養(yǎng)液，搖勻，按照10%體積比的接種量接入廢水培養(yǎng)基與AB培養(yǎng)基中，放在HPG-280BX光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：光照溫度為24.8℃，光照強(qiáng)度為4 000 lx，光暗周期為12 h∶12 h。每天觀察藻種生長狀態(tài)，560 nm處測定培養(yǎng)液OD值。培養(yǎng)不同時(shí)間的藻液，取一定體積，抽濾、用蒸餾水沖洗3次，把藻泥與已稱重量的濾紙取出一起放入已烘干至恒重的稱量瓶中，置于80℃烘箱加熱至恒重，稱重，求得光密度與干重的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 螺旋藻的吸光度值與干重的關(guān)系

判斷螺旋藻在不同的培養(yǎng)條件下生長的狀況，跟蹤測定其生物量是常用的方法。生物量測定有多種方法，如細(xì)胞干重法、光密度（OD）法等，從不同側(cè)面反映了相應(yīng)微藻的生長狀況，前者精確，費(fèi)時(shí)；后者便捷。因此，為了快速、方便的實(shí)現(xiàn)兩種指標(biāo)的互換，按照1.3.3方法操作，動(dòng)態(tài)檢測了螺旋藻培養(yǎng)液的吸光度值與干重的關(guān)系[7-8]，見圖1。

圖1 光密度與細(xì)胞干重的關(guān)系Fig.1 The relationship between the optical density and cell dry weight

由圖1可見，細(xì)胞干重與螺旋藻培養(yǎng)液OD560nm之間存在很好的線性關(guān)系，回歸可得：Y=10.664X+0.002 4。式中：Y為吸光度值；X為細(xì)胞干重值。因此，可以通過測定培養(yǎng)液的OD可以得到不同培養(yǎng)液的藻的生物量，為后續(xù)的研究工作提供方便。

2.2 采用廢水培養(yǎng)螺旋藻初探

2.2.1 廢水及AB培養(yǎng)基的一些理化指標(biāo)

溶液中的鹽度、pH是培養(yǎng)螺旋藻的重要指標(biāo)。可以直接采用電導(dǎo)儀和pH計(jì)測定溶液用電導(dǎo)率和pH。廢水和AB培養(yǎng)基的理化參數(shù)見表1。

表1 廢水及AB培養(yǎng)基的一些理化指標(biāo)Table 1 Some physical and chemical indicators of the wastewater and AB medium

從表1可知，廢水中的鹽的濃度和pH與AB培養(yǎng)基相差較大。

2.2.2 純凈水生產(chǎn)廢水直接培養(yǎng)螺旋藻初步研究

將螺旋藻按照10%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種于滅菌廢水中，觀察不同時(shí)間的培養(yǎng)液的顏色和吸光度值。結(jié)果見表2和表3。

由表2和表3可知，直接用廢水培養(yǎng)螺旋藻，螺旋藻不能生長，而且很快死亡，因此用廢水直接培養(yǎng)螺旋藻是不可行的，必須改變廢水的營養(yǎng)成分。

表2 廢水中鈍頂螺旋藻869的生長狀態(tài)Table 2 Spirulina platensis 869 growth state cultured in the wastewater

表3 培養(yǎng)液中鈍頂螺旋藻869的生長情況Table 3 Spirulina platensis 869 growth situation in the wastewater

2.3 螺旋藻在單因素改良廢水中的生長狀態(tài)研究

2.3.1 添加VB1、VB12對螺旋藻生長的影響

VB1、VB12等有機(jī)物有促進(jìn)生物生長繁殖的作用。有研究顯示VB1、VB12混合液對海洋原甲藻、赤潮生物的生長有顯著的促進(jìn)作用不同的藻類對于VB1、VB12有一定的相關(guān)性[9-10]。因此本實(shí)驗(yàn)首先探究通過添加VB1、VB12對廢水培養(yǎng)基培養(yǎng)螺旋藻生長情況的。以AB培養(yǎng)基為參考，1 L廢水加入1 mL VB12液，使其終濃度為0.15 μg/L為培養(yǎng)基，結(jié)果如表4，表5所示。

表4 廢水中只添加VB12鈍頂螺旋藻869的生長狀態(tài)Table 4 Spirulina platensis 869 growth state cultured in the wastewater modified with vitamin B12

表5 添加VB12后培養(yǎng)液中鈍頂螺旋藻869的生長情況Table 5 Spirulina platensis 869 growth situation in the wastewater modified with vitamin B12

通過實(shí)驗(yàn)可知只加入VB12來調(diào)節(jié)廢水培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，結(jié)果并沒有得到改善。由這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以推測廢水中的無機(jī)鹽含量應(yīng)該是影響鈍頂螺旋藻生長的主要原因。

2.3.2 添加K2HPO4對螺旋藻生長的影響

從廢水的理化參數(shù)表1可知，廢水與AB培養(yǎng)基在電導(dǎo)率上有較大的差異。因此，向廢水中加入一些可溶性的無機(jī)鹽，提高廢水溶液的電導(dǎo)率來研究螺旋藻生長情況。無機(jī)鹽有多種，包括N、P、S、K等。鮑亦璐等研究表明，螺旋藻培養(yǎng)過程中營養(yǎng)源消耗量為：N源（NO3-）、P 源（HPO42-）、S 源（SO42-），而 Cl-基本不消耗[11-12]。由凱氏定氮測定AB培養(yǎng)基和廢水中的總氮含量，顯示廢水中的氮含量要高于AB培養(yǎng)基中的（結(jié)果未顯示），因此不用再向廢水中添加氮源。

不添加或只添加VB12，培養(yǎng)螺旋藻都有藻體發(fā)黃的現(xiàn)象。有研究表明當(dāng)磷源不足時(shí)會(huì)影響螺旋藻葉綠體的含量，出現(xiàn)發(fā)黃的癥狀，所以磷源應(yīng)該是廢水中缺乏的一種營養(yǎng)成分[13]。向廢水中加入不同濃度的K2HPO4，對螺旋藻生長狀態(tài)和生物量的影響結(jié)果如表6，圖2所示。

表6 廢水中只添加K2HPO4鈍頂螺旋藻869的生長狀態(tài)Table 6 Spirulina platensis 869 growth state cultured in the wastewater modified with K2HPO4

圖2 添加K2HPO4后各種培養(yǎng)液中鈍頂螺旋藻869的生長曲線圖Fig.2 Spirulina platensis 869 growth curves cultured in the wastewater modified with K2HPO4

由表6和圖2可以看到，通過加入K2HPO4之后，鈍頂螺旋藻的生長狀況得到了改善。當(dāng)K2HPO4的濃度小于0.5 g/L時(shí)，藻生長量濃度增加不大，藻液呈黃綠色，表現(xiàn)出缺乏磷源。磷源濃度為0.5 g/L時(shí)，藻體生長正常，藻呈綠色，藻濃度一直呈現(xiàn)上升趨勢。磷源濃度達(dá)到0.6 g/L時(shí)，對藻生長并沒有起到有效地促進(jìn)作用，后期藻濃度略低于前者，從K2HPO4的添加量和藻生長情況綜合考慮，選擇0.5 g/L添加量作為廢水培養(yǎng)基的磷源添加濃度。

但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，盡管加入了磷源，鈍頂螺旋藻的生長狀況改善，與AB培養(yǎng)基中的螺旋藻相比較，藻體生長還是大幅落后。

2.3.3 添加NaHCO3對螺旋藻生長的影響

由表1顯示，廢水與AB培養(yǎng)基差異比較大的理化指標(biāo)之一是pH。NaHCO3除了可以調(diào)整廢水中的pH作用之外，還可以向螺旋藻提供C源。在螺旋藻的培養(yǎng)溶液中，CO2含量是非常低的，HCO3-則占了絕大部分，外源無機(jī)碳主要利用形式是HCO3-。同時(shí)NaHCO3可以起到保持培養(yǎng)基較強(qiáng)的堿性和pH緩沖作用，有利于防止其他藻類的污染[14-15]，向已添加0.5 g/L K2HPO4的廢水中分別加入不同濃度的NaHCO3進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，選擇出最適合的條件。結(jié)果如表7所示，并且由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制加入不同濃度的K2HPO4的各藻液的生長曲線見圖3。

表7 廢水中只添加NaHCO3鈍頂螺旋藻869的生長狀態(tài)Table 7 Spirulina platensis 869 growth state cultured in the wastewater modified with NaHCO3

圖3 添加NaHCO3各個(gè)培養(yǎng)液中鈍頂螺旋藻869的生長曲線圖Fig.3 Spirulina platensis 869 growth curves cultured in the wastewater modified with NaHCO3

由此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知在加入了NaHCO3之后，藻體的生長情況的得到了較好改善，在培養(yǎng)周期內(nèi)，藻體沒有出現(xiàn)發(fā)黃及死亡的現(xiàn)象。對圖3以及表7進(jìn)行分析，添加不同濃度的NaHCO3的培養(yǎng)基對照組，藻體生長良好。當(dāng)NaHCO3濃度小于8.0 g/L時(shí)，螺旋藻的生長遲緩，當(dāng)NaHCO3濃度達(dá)到8.0 g/L及以上時(shí)，廢水的pH增大至9以上，但是各種添加濃度之間，螺旋藻的生長狀態(tài)差異不顯著。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，生物量呈穩(wěn)步增值趨勢，第7天達(dá)到最大值。綜合考慮，選擇8.0 g/L NaHCO3添加量作為廢水培養(yǎng)基的碳源濃度。但是與同時(shí)培養(yǎng)的AB培養(yǎng)液相比，螺旋藻的生長狀況還是比較緩慢。

2.4 螺旋藻在綜合改良廢水中的生長狀態(tài)研究

雖然廢水經(jīng)過添加C、P無機(jī)鹽后，螺旋藻可以生長，但與AB培養(yǎng)基比較，還是有較大的差距。為了使螺旋藻更好的生長，在已經(jīng)添加了磷源和碳源的基礎(chǔ)上，再加入VB12，使其終濃度為0.15 μg/L，作為改良廢水（1），另外，在改良廢水（1）的基礎(chǔ)上，再按照 AB 培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加組分和濃度，添加As液和PIV液，作為廢水（2），觀察培養(yǎng)螺旋藻的生長情況。

表8 鈍頂螺旋藻869在改良廢水（1）和（2）的生長狀態(tài)Table 8 Spirulina platensis 869 growth state cultured in the improved wastewater（1）and（2）

圖4 鈍頂螺旋藻869在改良廢水（1）和（2）的生長曲線Fig.4 Spirulina platensis 869 growth curves cultured in the improved wastewater（1）and（2）

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，在添加了維生素液以及As液和PIV液之后，兩種廢水培養(yǎng)基與AB培養(yǎng)基中的螺旋藻相比較，它們的生長情況比較一致。在生長的前期，只添加了維生素液的培養(yǎng)基中的螺旋藻生長較快，這可能鈍頂螺旋藻能夠比較快的適應(yīng)它的營養(yǎng)環(huán)境，而對于另外兩種培養(yǎng)基則需要相對長一點(diǎn)的適應(yīng)期。到了第4天，廢水培養(yǎng)基（2）中的藻體生長很快，AB培養(yǎng)基中的螺旋藻顯然也加快了生長，這兩者的生長情況比較一致，藻液濃度增長的趨勢也很平穩(wěn)。到了第7天，廢水培養(yǎng)基（2）中的藻濃度達(dá)到最大值，吸光度為1.886。這一實(shí)驗(yàn)表明了廢水再經(jīng)過了一系列的調(diào)節(jié)后，培養(yǎng)螺旋藻的能力可以得到大幅度的提高。

3 結(jié)論

每升純凈水生產(chǎn)廢水中添加0.5 g K2HPO4，8 g NaHCO3、0.15 μg VB12，再按照 AB 培養(yǎng)基配方添加 As液和PIV液，在光強(qiáng)強(qiáng)度4 000 lx、溫度24.8℃，光暗周期為12 h∶12 h的條件下培養(yǎng)螺旋藻7 d，達(dá)到生物量1.766 g（DW）/L，與螺旋藻在傳統(tǒng)AB培養(yǎng)基和相同的培養(yǎng)條件下的生物量相當(dāng)。

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