趙成剛，瞿偉菁

（1.銅仁學(xué)院生物科學(xué)與化學(xué)系，貴州銅仁 554300；2.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062）

藥典載西紅花Stigma croci，為鳶尾科植物番紅花Crocus sativus L.的干燥柱頭[1]。性味與歸經(jīng)：甘、平。歸心，肝經(jīng)。功能與主治：活血化瘀，涼血解毒，解郁安神。用于經(jīng)閉癥瘕，產(chǎn)后瘀阻，溫毒發(fā)斑，憂郁痞悶，驚悸發(fā)狂[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明西紅花對腫瘤及癌癥[3-5]、冠心病[6]、肝炎及肝硬化[7]、高血脂癥[8]等多種疾病具有較好的防治作用。其藥用部位為柱頭，產(chǎn)量極低。

西紅花花瓣是制藥工業(yè)中的副產(chǎn)品，已有學(xué)者從中分離得到類黃酮、皂甙等物質(zhì)[9-10]，表明西紅花花瓣含有多種活性成分。現(xiàn)代藥理藥效顯示：具有抗憂郁癥和降動脈血壓的作用[11-12]，此外，未見其他相關(guān)報道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)西紅花花瓣中富含總黃酮和多糖等活性成分，其含量及生理活性，均具有形成產(chǎn)品的優(yōu)勢。本研究使用的西紅花花瓣是去掉花柱后的棄物，為實(shí)現(xiàn)資源深度開發(fā)、利用，從天然產(chǎn)物化學(xué)角度對西紅花花瓣總黃酮（Flavones from Petals ofCrocus Sativus，F(xiàn)PC）成分提取分離技術(shù)及其體外抗氧化能力進(jìn)行研究，為利用FPC工業(yè)化生產(chǎn)黃酮類藥用成分提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

西紅花花瓣：由浙江壽仙谷藥業(yè)有限公司提供（去掉花柱后的干燥花瓣）。于56℃烘干至恒重，粉碎成粉，過30目篩，石油醚脫脂，置干燥箱干燥后密封袋中避光備用。

1.1.2 試劑

山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品、1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrayl，DPPH）：sigma 公司；甲醇（色譜純）；石油醚（分析純）；水楊酸（分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

BS210S電子天平：Sartorius；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海醫(yī)械專機(jī)廠；UV-VIS7500紫外/可見分光光度計：上海天美科學(xué)儀器有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵：上海錦華層析設(shè)備廠；ZK-82A型真空干燥箱：上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠；Bio-tek exl 800酶聯(lián)免疫測定儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 FPC的提取工藝

工藝流程：西紅花花瓣→恒溫干燥→粉碎、過篩（30目）→精密稱量→石油醚脫酯→乙醇提取→過濾→定容→FPC提取液

1.3.2 總黃酮含量的測定

1.3.2.1 吸收波長的選擇

把山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品與西紅花提取液按照一定比例稀釋后，用分光光度計在200 nm～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，以甲醇為空白試劑，結(jié)果提示，供試品與山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品均在365 nm處有最大吸收故確定其為檢測波長。

圖1 山柰酚標(biāo)品與樣品全波長掃描圖Fig.1 Full wavelength scanning chart of kaempferol and FPC

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

在參照方法[13-14]的基礎(chǔ)上，有所改進(jìn)。準(zhǔn)確配制1 mg/mL的山奈酚標(biāo)準(zhǔn)液，取0.2 mL定容至5 mL，再分別取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 進(jìn)行測定，以山奈酚含量C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算機(jī)處理得回歸方程為：A=43.115C+0.006 7，R2=0.999 7。

1.3.2.3 樣品液制備和總黃酮得率的計算

圖2 山柰酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for kaempferol determination

精密量取1.3.1中FPC提取液0.2 mL用甲醇定容于5 mL試管中，并用相應(yīng)體積的甲醇作對照，按照1.3.2.2方法通過回歸方程計算相應(yīng)的總黃酮質(zhì)量濃度。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

分別研究乙醇濃度、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)、料液比對FPC含量的影響，重復(fù)3次。

1.3.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在選定料液比為1∶30的前提下，選取乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時間、提取溫度為試驗(yàn)因素進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計，重復(fù)3次，見表1。

表1四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計[L9（34）]Table 1Four factors three levels by orthogonal design L9（34）

1.3.3.3 對DPPH自由基清除能力試驗(yàn)

配置濃度分別為 1、2、4、8、10、16 mg/mL 的 FPC溶液。在1.9 mL，0.065 mmoL的DPPH乙醇溶液[15]中加入0.1 mL不同濃度的樣品溶液。反應(yīng)30 min，于517 nm下測定吸光度Ai。以相應(yīng)溶劑代替樣品作為空白對照，吸光度為Amax。

·DPPH 清除率/%=（1-Ai/Amax）× 100

1.3.3.4 羥基自由基（·OH）清除能力試驗(yàn)

參照Fenton反應(yīng)方法[16]建立·OH自由基產(chǎn)生體系模型。在試管中依次加入6 mmoL/L FeSO4溶液2 mL，多糖溶液 2 mL，6 mmoL/L H2O2溶液 2 mL，靜置10 min。再加入6 mmoL/L水楊酸溶液2 mL，靜置30 min后于510 nm處測吸光度A0，用蒸餾水代替樣品溶液測得吸光度Ax。

·OH 清除率/%=（1-A0/Ax）× 100

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以“±s”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 FPC提取工藝

2.1.1 乙醇濃度對浸提效果的影響

稱取5.00 g干燥后的西紅花花瓣粉末5份，分別加入乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液各100 mL，在提取溫度為70℃，提取時間1.0 h，料液比為1∶20的條件下進(jìn)行提取，見圖3。

圖3 乙醇濃度對得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield

由圖3可知，在較低乙醇濃度下得率較高，隨乙醇濃度升高得率反而下降，故選取較低的乙醇濃度進(jìn)行提取。

2.1.2 提取溫度對浸提效果的影響

為考察提取溫度對西紅花花瓣黃酮得率的影響。分別稱取5.00 g干燥后的西紅花花瓣粉末6份，分別加入乙醇濃度70%的乙醇溶液，提取時間1.0 h，料液比為 1∶20，在提取溫度為 30、40、50、60、70、80 ℃的條件下進(jìn)行提取，見圖4。

圖4 提取溫度對得率的影響Fig.4 Effect of temperature on the yield

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，黃酮得率不斷增加。在30℃～60℃時黃酮得率增加比較快，之后得率增加變緩，在60℃過后黃酮得率達(dá)到較高水平，故可以從該范圍選取適宜提取溫度。

2.1.3 提取時間對浸提效果的影響

選取合適的提取時間既能較好的提高得率，又能節(jié)約能源，從而降低成本。分別稱取5.00 g干燥后的西紅花花瓣粉末4份，分別加入濃度70%的乙醇溶液，提取溫度 70 ℃，料液比為 1∶20，在提取時間為 1、2、3、4 h的條件下進(jìn)行提取見圖5。

圖5 提取時間對得率的影響Fig.5 Effect of time on the yield

由圖5可知，在1 h～2 h內(nèi)黃酮得率增加較快，之后增加變緩，從節(jié)約成本等方面考慮，提取時間不宜過長。

2.1.4 料液比對浸提效果的影響

分別稱取5.00 g干燥后的西紅花花瓣粉末4份，分別加入濃度70%的乙醇溶液，提取溫度70℃，提取時間 1 h，在料液比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 的條件下進(jìn)行提取見圖6。

圖6 料液比對得率的影響Fig.6 Effect of the ratio of sample to water on the yield

由圖6可知，隨著料液比的增加，黃酮得率隨之增加。主要是由于溶劑中溶質(zhì)的濃度差和能夠溶解物質(zhì)的量都不斷增大的緣故。在1∶30后增大溶劑用量，得率增加不顯著，同時濃縮的難度加大，從節(jié)約能源方面考慮，溶劑體積不宜過大。

2.1.5 提取次數(shù)對浸提效果的影響

分別稱取5.00 g干燥后的西紅花花瓣粉末4份，分別加入濃度70%的乙醇溶液，在提取溫度70℃，料液比為1∶20，提取時間為1 h的條件下分別提取1次、2次、3次、4次見圖7。

圖7 提取次數(shù)對得率的影響Fig.7 Effect of extraction times on the yield

由圖7可知，隨著提取次數(shù)的增多，黃酮得率也隨之增加。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of orthogonal test

結(jié)果表明，因素提取次數(shù)試驗(yàn)組的極差最大，達(dá)到2.429，醇提濃度其次，提取溫度次之。即4種考察因素對FPC提取效果影響的主次順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)＞乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間；根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果可知，F(xiàn)PC提取的最佳提取工藝為：乙醇濃度為60%，提取溫度為70℃，提取時間為2 h，提取次數(shù)為3次。

2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

精密稱取西紅花花瓣粉末5.00 g，共5份，按最佳提取工藝條件提取，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得平均總黃酮含量為20.451 mg/g，RSD為0.591%，可見該工藝穩(wěn)定可行。

2.4 對DPPH自由基清除能力的測定

·DPPH是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，含有單個電子，其乙醇水溶液呈紫色。有自由基的清除劑存在時，DPPH的單電子被捕捉而使其顏色變淺，在最大光吸收波長處的吸光值下降。FPC對DPPH自由基的清除能力見圖8。

圖8FPC對DPPH自由基的清除能力Fig.8 Scavenging effects of FPC on DPPH

由圖8可以看出，隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加，對DPPH自由基的清除率迅速增強(qiáng)；當(dāng)FPC為10.076mg/mL時，清除率為 50%，IC50=（10.076 ±1.03）mg/mL，顯示出較高的體外清除DPPH自由基的的活性。

2.5 對羥自由基（·OH）的清除作用

H2O2和Fe2+混合后，可生成具有很高反應(yīng)活性的·OH。在體系中加入水楊酸后，能有效的捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm處有強(qiáng)吸收。若加入具有清除·OH作用的物質(zhì)，便會與水楊酸競爭，使有色產(chǎn)物生成量減少，F(xiàn)PC對·OH的清除作用見圖9。

圖9 FPC對羥自由基（·OH）的清除能力Fig.9 Scavenging effects of FPC on·OH

圖9顯示當(dāng)FPC濃度為1.0 mg/mL時，對·OH的清除率為（24.473±0.124）%，隨著FPC濃度的增加，其對·OH的清除能力增強(qiáng)，表明FPC對·OH的清除力與其濃度具有一定的量效關(guān)系。當(dāng)FPC濃度為2.0 mg/mL時，清除率達(dá)50%，即IC50=4.605 mg/mL；FPC濃度為10.0mg/mL時，對羥自由基清除率達(dá)到（89.925±2.598）%，體現(xiàn)了FPC良好的清除·OH的活性作用。

3 結(jié)論

通過單因素與正交試驗(yàn)結(jié)果分析得出：對西紅花花瓣粉末提取效果影響因素大小為：提取次數(shù)＞乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間。FPC提取的最佳提取工藝為：乙醇濃度為60%，提取溫度為70℃，提取時間為2 h，提取次數(shù)為3次。

抗氧化試驗(yàn)結(jié)果說明：對·OH和·DPPH具有較強(qiáng)的清除能力，抑制率分別為（89.925±2.598）%和（66.193±1.32）%，可能FPC清除·OH、·DPPH的物質(zhì)基礎(chǔ)或作用機(jī)理有所不同。上述試驗(yàn)結(jié)果提示FPC可能對生物機(jī)體具有保健功效，為其藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。本試驗(yàn)采用工業(yè)廢棄物為原材料，變廢為寶，合理利用了西紅花植物資源，具有較高的經(jīng)濟(jì)意義。

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