任苑蓉 王玉麗 劉紅雨 閆惠琴 陳軍 侯梅 李為民 范亞光 周清華

硒作為一種人體必需的微量元素和天然的防癌抑癌制劑，越來越受到腫瘤學(xué)界的關(guān)注。甲基硒酸（methylseleninic acid, MSA）是一種新型的人工合成的硒化合物，以其廣泛的抗癌效應(yīng)和無需體內(nèi)代謝酶轉(zhuǎn)化而直接作用于靶細(xì)胞的特性成為最具潛力的硒化合物抗癌制劑[1]。為進(jìn)一步探明MSA對(duì)腫瘤的抑制作用，本研究應(yīng)用精諾真活體動(dòng)物可見光成像系統(tǒng)（IVIS imaging system 200 Series），研究了MSA對(duì)肺癌細(xì)胞株L9981-Luc裸鼠移植瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株L9981-Luc，由天津市肺癌轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，已經(jīng)證明其在體內(nèi)外均能持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)熒光素酶基因，且發(fā)光值和細(xì)胞數(shù)成明顯直線相關(guān)[2]。甲基硒酸由美國(guó)加利福尼亞大學(xué)Allen C. Gao教授（Department of Urology and Cancer Center, UC Davis School of Medicine, Sacramento, CA）提供。順鉑（DDP）購(gòu)自齊魯制藥有限公司（批號(hào)：030801）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用BALB/c裸鼠，購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司，雌性，6周齡，質(zhì)量為18 g-20 g。

Artagain黑紙（Strathmore, Catalog445-109）；注射器、鑷子、手術(shù)剪；熒光素（Luciferin）購(gòu)自上海睿星基因技術(shù)有限公司；麻醉劑異氟烷（isoflurane）24孔板，Greiner公司產(chǎn)品；RPM I-1640培養(yǎng)基、新生小牛血清購(gòu)自GIBCO公司；精諾真活體動(dòng)物可見光成像系統(tǒng)（IVIS imaging system 200 Series）型號(hào)：IVIS200，美國(guó)Xenogen Corporation產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和接種 L9981-Luc細(xì)胞株在含10%的小牛血清及PRM I-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，傳代擴(kuò)增，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備懸液，調(diào)整每組細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/m L；臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞占95%以上。SPF環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，每只裸鼠右后腿腹股溝處皮下接種細(xì)胞懸液0.1 mL/只。

1.2.2 溶液配制方法 稱取10 mg甲基硒酸，加入5 m L生理鹽水，配成2 mg/m L甲基硒酸溶液，從其中取2 m L，加入14 m L生理鹽水，即配成0.25 mg/mL甲基硒酸溶液；將4 mg/m L的順鉑溶液稀釋10倍，即配制成0.4 mg/m L的順鉑溶液。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 6周齡裸鼠，體重約16 g-18 g，共15只，隨機(jī)分為3組，每組5只，接種第3天開始給藥：對(duì)照組每日腹腔注射生理鹽水0.2 m L，連續(xù)14天；甲基硒酸組每日每只腹腔注射甲基硒酸溶液50 μg（0.2 m L），連續(xù)14天；順鉑組每周每只腹腔注射順鉑4 mg/kg。

1.2.4 抑瘤率的計(jì)算

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件。本組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物處理組不同時(shí)間L9981-Luc原位瘤發(fā)光強(qiáng)度的比較（圖1） 皮下接種L9981-Luc肺癌細(xì)胞株的熒光信號(hào)在接種后逐漸增強(qiáng)。接種后第7天，所有裸鼠接種部位皮下均可探測(cè)到1×105-1×106數(shù)量級(jí)的信號(hào)強(qiáng)度，隨時(shí)間增加，原發(fā)瘤和胸部轉(zhuǎn)移信號(hào)均同步增加（圖2）。接種后第0-14天，不同組人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981-Luc移植瘤在裸鼠體內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）；用藥第21天，不同組間移植瘤發(fā)光值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）（表2）；兩兩比較：對(duì)照組發(fā)光值顯著高于順鉑組（P=0.001），對(duì)照組發(fā)光值顯著高于甲基硒酸組（P=0.031），甲基硒酸和順鉑組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.147）。MSA組抑瘤率為25.20%，DDP組67.29%（圖3）。

表 1 0-14天不同藥物處理組L9981-Luc原位瘤發(fā)光強(qiáng)度的比較（Mean±SD）Tab 1 Com parison o f the bio lum inescence (p/s) o f p rim ary tum o r o f L9981-Luc treated w ith d ifferen t d rugs d0-d14 (Mean±SD)

圖 1 不同藥物處理組和不同時(shí)間組間人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981-Luc原位移植瘤發(fā)光強(qiáng)度比較Fig 1 Com parison o f p lan ted tum o r g row th o f L9981-Luc treated w ith d ifferent d rugs in nude m ice

圖 2 與MSA組比較，對(duì)照組活體內(nèi)移植瘤和轉(zhuǎn)移瘤信號(hào)值隨時(shí)間遞進(jìn)而逐漸增強(qiáng)Fig 2 Com pared w ith MSA group, bio lum inescence o f p rim ary tum or and m etastases in the thoracic area in the contro l g roup w as gradually increased as tim e increased

圖 3 分別在第7、14、21天測(cè)量各藥物處理組各只裸鼠移植瘤發(fā)光信號(hào)值，計(jì)算平均值，兩兩比較，對(duì)照組明顯高于順鉑和甲基硒酸組（P＜0.001)，甲基硒酸組明顯高于順鉑組（第21天，P＜0.05）。Fig 3 Measure the m ean bio lum inescence (p/s) of p rim ary p lan ted tum o r on d7, d14, d21. The m ean bio lum inescence o f the p lan ted tum or in con tro l group w as rem arkab ly higher than that in the DDP g roup and MSA group (P＜0.001), MSA g roup w as rem arkab ly h igher than that in con tro l g roup on d21 (P＜0.05).

表 2 第21天不同藥物處理組L9981-Luc原位瘤發(fā)光強(qiáng)度的比較（Mean±SD）Tab 2 Com parison o f the p rim ary tum o r bio lum inescence (p/s) o f L9981-Luc treated w ith d ifferen t d rugs on d21 (Mean±SD )

2.2 不同藥物處理組間L9981-Luc移植瘤肺轉(zhuǎn)移情況的比較 于接種后第7天開始觀察到不同藥物處理組胸部轉(zhuǎn)移信號(hào)，發(fā)光值隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，分別在d7、d14、d21測(cè)量各藥物處理組各只裸鼠胸部轉(zhuǎn)移信號(hào)值（圖4），計(jì)算平均值，對(duì)照組發(fā)光值明顯高于順鉑和甲基硒酸組，甲基硒酸組高于順鉑組（P＞0.05）。MSA組抑瘤率為17.14%，DDP組為48.30%（表3，圖5）。

2.3 各組裸鼠體重改變的比較 對(duì)照組裸鼠體重平均增加2.10 g，體重增加率為12.6%，甲基硒酸組平均體重增加2.10 g，體重增加率為11.9%，順鉑組平均體重變化為-0.64 g，變化率為-3.59%，不同藥物處理組間裸鼠體重增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.038）；兩兩比較，對(duì)照組裸鼠體重增加值明顯高于順鉑組（P=0.029），甲基硒酸組裸鼠體重增加值明顯高于順鉑組（P=0.034）（表4）。

圖 4 分別在第7、 14、21天測(cè)量各藥物處理組裸鼠胸部轉(zhuǎn)移信號(hào)值，計(jì)算平均發(fā)光值，對(duì)照組明顯高于順鉑和甲基硒酸組（P＜0.001），甲基硒酸組高于順鉑組（P＞0.05）。Fig 4 Measu re the m ean bio lum inescence (p/s) o f m etastases in the tho racic area on d7, d14, d21. The m ean b io lum inescence o f the m etastases in contro l group w as rem arkab ly higher than that in the DDP g roup and MSA g roup (P＜0.001), MSA g roup w as rem arkab ly higher than that in con tro l g roup (P＞0.05).

表 3 不同藥物處理組間L9981-Luc胸部轉(zhuǎn)移信號(hào)發(fā)光強(qiáng)度的比較（Mean±SD）Tab 3 Com parison o f the m ean bio lum inescence (p/s) o f thoracic area m etastases o f L9981-Luc treated w ith d ifferen t d rugs over tim e (Mean±SD)

表 4 用藥前后各組小鼠體重變化情況（Mean±SD）Tab 4 The w eigh t change befo re and after d rug use (Mean±SD)

圖 5 不同藥物處理組和不同時(shí)間人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981-Luc在裸鼠胸部轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)的組間比較Fig 5 Com parison o f m etastatic tum o r g row th o f L9981-Luc p lan ted tum or treated w ith different d rugs in nude m ice

3 討論

本研究將帶有熒光素酶基因（Luc）的質(zhì)粒PGL4.17經(jīng)陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)入人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981中，反復(fù)傳代培養(yǎng)，篩選出高效穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株L9981-Luc。該細(xì)胞株能在體內(nèi)外高效、持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)熒光素酶基因；細(xì)胞株發(fā)光值和細(xì)胞數(shù)目呈直線線性關(guān)系（R2=0.973）； L9981-Luc細(xì)胞株在小鼠體內(nèi)具有高成瘤和高轉(zhuǎn)移特性，應(yīng)用精諾真活體動(dòng)物可見光成像系統(tǒng)（IVIS imaging system 200 Series）能直觀地觀察活體內(nèi)原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤的情況；原發(fā)瘤重量和發(fā)光值呈直線線性關(guān)系（R2=0.900）[2]。IVIS系統(tǒng)具有高靈敏度，與傳統(tǒng)方法相比，在肉眼尚不能發(fā)現(xiàn)腫瘤的時(shí)候即可使用該方法觀察、量化活體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此在早期即可開始對(duì)動(dòng)物皮下自發(fā)轉(zhuǎn)移模型進(jìn)行藥物處理。生物發(fā)光反映的是具有代謝活力細(xì)胞的數(shù)量，與通過測(cè)量腫瘤體積判斷腫瘤細(xì)胞負(fù)荷的方法相比，避免了腫瘤周邊水腫、腫瘤組織內(nèi)壞死細(xì)胞和組織的干擾，更有效的反映了藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

硒是人類和哺乳動(dòng)物必需的微量元素，許多流行病學(xué)資料和一些臨床試驗(yàn)已初步證明超營(yíng)養(yǎng)水平的硒攝入量對(duì)于包括食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌及肺癌等各系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生具有預(yù)防作用[3-5]。劉潔薇等[6]在體外應(yīng)用甲基硒酸處理L9981細(xì)胞株，觀察到甲基硒酸可明顯抑制人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981的體外增殖和克隆形成能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；同時(shí)可明顯上調(diào)Fas、FasL、 Bax、 p21、 p53和cyclinD1基因表達(dá)水平。本研究觀察到在活體動(dòng)物體內(nèi)，甲基硒酸對(duì)L9981-Luc細(xì)胞的原發(fā)瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)甲基硒酸抗腫瘤作用的研究做了重要補(bǔ)充。本研究同時(shí)觀察到在裸鼠體內(nèi)，甲基硒酸具有抑制肺癌細(xì)胞株L9981-Luc移植瘤肺轉(zhuǎn)移的趨勢(shì)，但其確切機(jī)理有待進(jìn)一步研究。通過各組裸鼠體重的觀察比較，觀察到50 μg甲基硒酸毒性小于順鉑的毒性作用，甲基硒酸組可較好的耐受，兩者聯(lián)合應(yīng)用是否可以增加療效有待進(jìn)一步研究。

硒化合物抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與其抑制腫瘤血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力等有關(guān)[7]，有可能成為新的肺癌化療的輔助治療手段，有待于進(jìn)一步研究。