單莉 張琰 趙峰 鄭立謀 張國慶

肺癌是世界范圍內(nèi)常見的癌癥，發(fā)病率和死亡率居各癌癥之首。據(jù)2010年我國衛(wèi)生部的統(tǒng)計(jì)，肺癌死亡率為30.83/10萬。肺癌已經(jīng)成為發(fā)病率和死亡率第1位的惡性腫瘤，其5年生存率僅為15%[1-3]。表皮生長因子（epidermal growth factor receptor, EGFR）是一種跨細(xì)胞膜糖蛋白，屬于受體型酪氨酸激酶，EGFR信號(hào)通路在細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。EGFR基因在多種腫瘤中存在突變或過表達(dá)，并通過其介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)控腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管新生[4-6]。以吉非替尼為代表的EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）靶向藥物在肺癌的治療中顯示出良好的治療效果，然而，該類藥物的治療效果在不同個(gè)體間存在很大差異。多項(xiàng)臨床研究[5,7-12]顯示，EGFR基因外顯子18-21突變是導(dǎo)致不同個(gè)體間治療效果差異的主要原因。因此，根據(jù)EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果選擇合適的治療對(duì)象，對(duì)于提高患者治療效果、延長患者的生存期有重要意義。目前，已有的肺癌EGFR突變研究還沒有針對(duì)維吾爾族突變率的報(bào)道。本研究檢測(cè)了68例維吾爾族和70例漢族肺癌患者的EGFR基因，首次報(bào)道了維吾爾族肺癌EGFR基因突變率，并對(duì)維吾爾族和漢族EGFR基因突變率進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集醫(yī)院維吾爾族肺腺癌患者石蠟包埋組織標(biāo)本68例，其中男性39例，女性29例；年齡30歲-75歲，中位年齡52歲。漢族肺腺癌患者石蠟包埋組織標(biāo)本70例，其中男性49例，女性21例；年齡35歲-79歲，中位年齡57歲。

1.2 標(biāo)本采集與DNA提取 采用病理石蠟切片樣品，5 μm切片，不少于8片，室溫保存。所用樣品均為病理診斷確定含有腫瘤組織的蠟塊切片，并且保存時(shí)間不超過兩年。取石蠟標(biāo)本組織，用QIAGEN公司核酸提取試劑盒提?。≦IAamp? DNA FFPE Tissue Kit，商品號(hào)：564074）DNA， 所提DNA溶于Tris-HCl（10 mmol/L, pH8.0），經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取質(zhì)量，并確定濃度，用Tris-HCl溶液（10 mmol/L, pH 8.0）調(diào)整DNA濃度到10 ng/μL和2 ng/μL備用。

1.3 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增 采用ARMS （amplification refractory mutation system, ARMS）方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)EGFR基因外顯子18、19、20和21突變。用廈門艾德生物醫(yī)藥科技公司EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒（人類EGFR基因21種突變檢測(cè)試劑盒）進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)具體操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用StrataGene MX3000P實(shí)時(shí)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，每次檢測(cè)樣品包括1個(gè)陽性質(zhì)控品、1個(gè)NTC對(duì)照。如果Ct值為0或Ct值＞30，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果判為野生型。所述熒光PCR的反應(yīng)條件：95oC預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；95oC變性25 s，64oC退火20 s，72oC延伸20 s，15個(gè)循環(huán)；93oC變性25 s，60oC退火35 s，72oC延伸20 s，31個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2和Fisher精確檢驗(yàn)分析突變差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

共檢測(cè)138例肺腺癌的樣本，包括68例維吾爾族、70例漢族，共檢測(cè)出43例突變，檢測(cè)總突變率為31.2%。維吾爾族突變11例，突變率為16.2%，漢族突變32例，突變率為45.7%，以外顯子19和21突變較為多見。維吾爾族EGFR突變率明顯低于我國漢族EGFR突變率（χ2=14.03,P＜0.001），結(jié)果見表1，突變比例分析圖見圖1。

在檢測(cè)的肺腺癌EGFR基因突變中，突變點(diǎn)包括19-del突變和外顯子21的L858R突變，其中維吾爾族外顯子19-del突變6例，占突變數(shù)的54.5%，L858R突變5例，占突變數(shù)的45.5%。漢族19-del突變12例，占突變數(shù)的37.5%。L858R突變20例，占突變數(shù)的62.5%。 維吾爾族外顯子19和外顯子21（L858R）的突變率與漢族外顯子19和外顯子21（L858R）的突變率相比無明顯差異（P=0.48）（表2）。

圖 1 維吾爾族與漢族肺腺癌EGFR基因突變比較Fig 1 Histog ram com parison o f EGFR m u tations betw een Uighu r lung ad enocarcinom a and Han lung adenocarcinom a. EGFR: ep id erm a l g row th factor recep tor.

表 1 維吾爾族與漢族肺腺癌EGFR基因突變統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab 1 EGFR m u tation com parison betw een Uighu r lung adenocarcinom a and Han lung adenocarcinom a

表 2 EGFR基因外顯子19與外顯子21突變分析Tab 2 The analysis o f EGFR m utations in Exon 19 and Exon 21

3 討論

EGFR屬于表皮生長因子ErbB家族，該家族包括HER1、HER2、HER3和HER4四個(gè)成員。EGFR是一種細(xì)胞表面膜蛋白受體，由1,186個(gè)氨基酸組成，分子量為170 kDa，由三個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域組成，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸區(qū)[13]。當(dāng)EGFR與其相應(yīng)的信號(hào)分子結(jié)合后，受體分子之間會(huì)形成二聚體，兩個(gè)受體胞內(nèi)的酪氨酸激酶彼此作用而相互磷酸化，并啟動(dòng)胞內(nèi)的級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，從而引起細(xì)胞內(nèi)一系列形態(tài)學(xué)的改變[13-15]。

EGFR基因在多種腫瘤會(huì)存在突變或者過表達(dá)，并通過其下游信號(hào)通路調(diào)控腫瘤的生長、增殖和轉(zhuǎn)移。目前，常用EGFR-TKIs主要包括吉非替尼和厄洛替尼，是治療肺癌最有效的靶向藥物。然而，該類藥物對(duì)EGFR突變患者的有效率高達(dá)80%以上，而對(duì)野生型患者幾乎沒有療效，因此，檢測(cè)EGFR的突變情況是肺癌化療預(yù)后重要標(biāo)志物。研究表明，不同人種肺癌的EGFR突變率差異較大，Schm id等[16]和Kris等[17]通過對(duì)大量肺癌病例研究發(fā)現(xiàn)，高加索人（Caucasian）肺癌EGFR突變率約為7%-17%。Li等[18]通過對(duì)202例肺腺癌患者發(fā)現(xiàn)，我國漢族人的肺腺癌EGFR突變率為75.3%。Han[19]和Hsu等[20]的研究進(jìn)一步表明，東亞人的肺腺癌EGFR突變率約為30%-62%。本研究首次對(duì)維吾爾族肺腺癌EGFR突變進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明維吾爾族肺腺癌EGFR突變率為16.2%，其突變率明顯低于我國漢族肺腺癌EGFR突變率，略高于高加索人EGFR突變率。本研究對(duì)維吾爾族肺腺癌EGFR突變檢測(cè)為臨床醫(yī)生提供了重要參考信息，有益于其肺腺癌的個(gè)體化治療。

從地域分布來看，漢族人與日本人居源于東亞大陸，高加索人居源于歐洲大陸，維吾爾族人居于歐洲大陸和東亞大陸之間。居源于東亞大陸人肺腺癌EGFR突變率較高，居源于歐洲大陸的人肺腺癌EGFR突變率較低，維吾爾族人所居區(qū)域突變率介于兩者之間，肺腺癌EGFR突變率從歐洲大陸到東亞大陸表現(xiàn)出突變率逐漸增大的趨勢(shì)。

肺腺癌EGFR基因外顯子19缺失突變是吉非替尼類藥物作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其缺失突變可引起酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中4個(gè)氨基酸殘基的缺失，從而導(dǎo)致EGFR-ATP受體結(jié)合域的角度改變，使吉非替尼類藥物更易結(jié)合到該位點(diǎn)，通過阻止ATP進(jìn)入而阻斷EGFR激酶活性[21]。本研究檢測(cè)了68例維吾爾族和70例漢族肺腺癌EGFR基因，發(fā)現(xiàn)EGFR總突變率為31.2%，維吾爾族的突變率為16.2%，其中外顯子19-del突變的突變率較高，占突變比例的54.5%。在漢族中EGFR突變率為45.7%，其中外顯子19的缺失突變的突變率有12例，占突變比例的37.5%，維吾爾族EGFR基因外顯子19缺失突變的突變率略高于漢族的外顯子19缺失突變的突變率，分析表明維吾爾族肺腺癌EGFR基因外顯子19突變率與漢族外顯子19突變率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.48）。

綜上所述，本研究表明維吾爾族肺腺癌患者EGFR基因突變率明顯低于我國漢族EGFR基因突變率。EGFR基因突變與EGFR-TKIs藥物治療敏感性明顯相關(guān)，基于EGFR的突變情況來選擇EGFR-TKIs的藥物進(jìn)行化療已成為臨床醫(yī)生的共識(shí)，本研究首次提供維吾爾族肺腺癌的EGFR突變率信息，可以為臨床醫(yī)生提供有益參考，使廣大肺腺癌患者受益。

Acknowledgement

We thank Qing Shao for great help in statistical analysis,data processing, language revision and fruitful discussions.