汪龍強 雷哲 劉霞 劉仍允 張洪濤

肺癌包括非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC），是世界上發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤之一，其中NSCLC約占肺癌總數(shù)的80%-85%。每年的癌癥死亡患者中，NSCLC因預(yù)后差、治療效果不明顯、存活率低等原因而占據(jù)首位[1]。近30年來，盡管在肺癌治療方面有了一定的進(jìn)展，但由于肺癌生物學(xué)特性十分復(fù)雜，惡性化程度高，肺癌患者的生存率仍然不容樂觀。

TIF1γ（transcription intermediary factor 1 gamma）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤抑制因子，是一種普遍存在的核蛋白屬于轉(zhuǎn)錄中介因子1家族的成員，因TIF1γ可作為轉(zhuǎn)錄輔助因子阻斷TGF-β/Smad信號通路而受到廣泛的關(guān)注[2,3]。TIF1γ的典型特征是在N末端有三個結(jié)構(gòu)域，包括一個RING、兩個B-box（一個I型B-box、一個II型B-box）和一個coiled-coil結(jié)構(gòu)域；在C末端有一個PHD結(jié)構(gòu)域和一個bromo結(jié)構(gòu)域[4,5]。

TGF-β（transforming growth factor β）是一類具有多功能生物活性的細(xì)胞因子，能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、粘附、侵襲和微環(huán)境來調(diào)節(jié)機體的生理過程[6]。典型的TGF-β信號通路首先是TGF-β與II型TGF-β受體（TGFβRII）結(jié)合，然后與I型TGF-β受體（TGFβRI）形成復(fù)合物使之激活，TGFβRI磷酸化激活R-Smad（Smad1、2、3、5、8）成員，R-Smad再與Co-Smad（Smad4）結(jié)合形成復(fù)合物轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[7]。對TIF1γ的功能研究表明TIF1γ在體內(nèi)主要是通過影響TGF-β信號通路的傳導(dǎo)發(fā)揮作用，TIF1γ可通過其C末端的PHD結(jié)構(gòu)域，經(jīng)泛素化途徑降解Smad4在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)或者競爭性的與Smad4結(jié)合從而抑制R-Smad與Smad4的結(jié)合，使TGF-β信號通路傳導(dǎo)受阻，影響TGF-β介導(dǎo)的生物學(xué)過程[8,9]。

研究[10]顯示，TIF1γ在多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)減弱和缺失，TIF1γ可與TIF1α或TIF1α和TIF1β形成調(diào)節(jié)復(fù)合物抑制小鼠肝癌的發(fā)生，TIF1γ的表達(dá)減弱可促進(jìn)小鼠肝癌的發(fā)生。同樣，在TGF-β誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialto-mesenchymal transition, EMT）過程中，TIF1γ可拮抗性地與Smad4作用，TIF1γ的表達(dá)缺失可促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的EMT[11]。在小鼠胰腺癌的發(fā)生過程中，TIF1γ也可通過非依賴于Smad4的途徑抑制小鼠胰腺癌的發(fā)生[12]。這些實驗表明TIF1γ在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起到抑癌基因的作用。

然而，有關(guān)TIF1γ在肺癌細(xì)胞中是否異常表達(dá)、肺癌細(xì)胞中TIF1γ表達(dá)調(diào)控機制以及TIF1γ與肺癌發(fā)生關(guān)系的研究仍未見報道。本研究采用Real-time PCR和Western blot方法檢測13對NSCLC組織和2株NSCLC細(xì)胞株（A549和95C）以及1株正常人支氣管上皮細(xì)胞（human bronchial epithelial cell, HBE）中TIF1γ mRNA和蛋白的表達(dá)，并用DNA測序和Bisulfite-sequencing PCR（BSP）克隆測序方法分析HBE、A549以及95C中TIF1γ基因啟動子區(qū)突變和甲基化情況。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及細(xì)胞 13例NSCLC組織樣本為蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院2011年1月-2012年1月新鮮手術(shù)切除樣本，患者手術(shù)前均未接受放、化療。腫瘤組織均取自腫瘤中心非壞死部位，癌旁組織取自腫瘤旁約5 cm正常肺組織，所有樣本均在醫(yī)院病理科經(jīng)H&E染色以確定肺癌樣本含有足夠的癌細(xì)胞（通常癌細(xì)胞含量＞70%），并且經(jīng)過仔細(xì)病理檢驗以確診和確定腫瘤的組織分化類型。組織標(biāo)本切除后30 min內(nèi)入液氮保存。實驗用3株細(xì)胞分別是：HBE是正常人支氣管上皮細(xì)胞，A549、95C分別是具有轉(zhuǎn)移傾向的和低轉(zhuǎn)移的NSCLC細(xì)胞株。

1.2 熒光實時定量PCR（Real-time PCR）檢測TIF1γ基因的表達(dá) 采用Trizole一步法進(jìn)行組織和細(xì)胞總RNA的提取，采用nanodrop2000分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度、純度和完整性。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV first strand kit（Invitrogen）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix（Invitrogen）熒光實時定量試劑盒檢測基因mRNA表達(dá)量。熒光實時定量PCR的循環(huán)條件為：95oC預(yù)變性10 min，進(jìn)入40個循環(huán)，95oC變性30 s，62oC退火30 s，72oC延伸1 min，并收集熒光信號，72oC延伸10 min，終止反應(yīng)。TIF1γ以及內(nèi)參引物見表1。

1.3 Western blot法檢測TIF1γ蛋白表達(dá) 所有細(xì)胞和組織總蛋白的提取步驟嚴(yán)格按照蛋白提取試劑盒ProteoJETTMMammalian Cell Lysis Reagent（Fermentas）說明書操作，提取中加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑（Sigma）防止蛋白降解，之后用Thermo公司nanodrop2000分光光度計檢測蛋白的濃度和純度。蛋白經(jīng)SDS-PAGE變性分離、濕法轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、洗脫、孵育二抗、洗脫、ECL顯色、壓片后最終檢測出TIF1γ蛋白在正常人支氣管上皮細(xì)胞HBE和NSCLC細(xì)胞A549和95C中的表達(dá)情況。

1.4 DNA的抽提 采用酚-氯仿抽提法抽提DNA。提取出來的DNA用nanodrop2000分光光度計測定濃度和純度。

1.5 重亞硫酸鹽修飾基因組DNA 采用EpiTect Bisulfite Kit試劑盒（QIAGEN）對基因組DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽修飾。

1.6 重亞硫酸鹽測序PCR（Bisulfite Sequencing PCR, BSP）法檢測TIF1γ基因啟動子區(qū)甲基化 經(jīng)修飾的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增所需片段，引物FP：TTTAGTTAAAGGTTA TTTAGCGTTA；RP：AACAAAAACGACAACCGAAAA。PCR反應(yīng)體系25 μL如下：2×MightyAmp Buffer 12.5 μL；Primer F 1.0 μL；Primer R 1.0 μL；MightyAmp聚合酶 0.5 μL；ddH2O 8.0 μL；DNA模板 2.0 μL。PCR循環(huán)條件為：98oC預(yù)變性2 min，進(jìn)入35個循環(huán)，98oC變性10 s，60oC退火15 s，68oC延伸1 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外燈下觀察。

1.7 PCR產(chǎn)物的T載體克隆 通過PCR擴增目的基因片斷，將獲得的目的片斷通過TA克隆的方法重組到T載體中，經(jīng)轉(zhuǎn)化后將連接有目的片段的質(zhì)粒抽提，用BigDye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit在ABI 377自動序列分析儀上測序。

1.8 基因突變分析 PCR方法擴增TIF1γ基因啟動子區(qū)上游-287--5序列，將獲得的目的DNA片段直接測序分析。

1.9 統(tǒng)計分析 所有統(tǒng)計分析均通過SPSS v17.0統(tǒng)計軟件完成。利用單因素方差分析統(tǒng)計多組數(shù)據(jù)間的差異。P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 TIF1γ mRNA和蛋白表達(dá)情況 TIF1γ在正常支氣管上皮細(xì)胞HBE中的mRNA表達(dá)高于A549和95C這兩種NSCLC細(xì)胞株（P＜0.001）（圖1A）。Western blot檢測顯示TIF1γ蛋白在各株細(xì)胞中的表達(dá)與mRNA的表達(dá)相一致（圖1B、C）。對13例NSCLC癌與癌旁組織樣本中TIF1γ的mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)9個癌旁組織樣本中TIF1γ的mRNA表達(dá)高于癌組織樣本，說明TIF1γ在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中可能起到抑癌作用。

2.2 TIF1γ基因啟動子區(qū)甲基化情況 在針對小鼠和人的慢性單核型細(xì)胞白血病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，甲基化可以影響TIF1γ蛋白在小鼠和人的慢性單核型細(xì)胞白血病患者細(xì)胞中的表達(dá)[13]。圖2A顯示了TIF1γ啟動子-5--287區(qū)域所有CpG位點，通過BSP測序發(fā)現(xiàn)該序列中存在5個可被甲基化修飾的CpG位點：-214、-128、-124、-65、-55（圖2B）。并單獨計算每個位點甲基化頻率（圖2C）。盡管這5個CpG位點單獨的甲基化頻率在HBE、A549和95C細(xì)胞中并未見明顯差異，但我們并不能排除其它細(xì)胞可通過這5個CpG位點的甲基化調(diào)控TIF1γ的表達(dá)。

2.3 TIF1γ基因啟動子區(qū)突變分析 通過PCR法擴增TIF1γ基因啟動子區(qū)DNA序列，然后直接測序。經(jīng)檢測，未見突變發(fā)生（圖3）。

3 討論

研究[13]表明，在人和小鼠的慢性白血病發(fā)生過程中，TIF1γ可作為轉(zhuǎn)錄輔助因子抑制TGF-β/Smad信號通路，從而抑制癌變。TGF-β信號通路在癌癥的發(fā)生過程中起著重要的作用，在正常細(xì)胞中TGF-β作為癌癥抑制因子通過抑制細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡阻止癌癥的進(jìn)程，然而在晚期癌癥細(xì)胞中TGF-β可作為癌癥促進(jìn)因子促進(jìn)癌細(xì)胞的侵入和血管的生成[14]。TIF1γ與R-Smad競爭結(jié)合Smad4或者通過泛素化途徑降解Smad4都可使晚期促癌的TGF-β信號減弱，從而起抑癌的作用[8,9]。本研究通過檢測TIF1γ在13對癌與癌旁組織中的mRNA表達(dá)以及檢測TIF1γ在HBE和A549、95C細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)預(yù)測TIF1γ與NSCLC發(fā)生的關(guān)系，結(jié)果表明TIF1γ在NSCLC的發(fā)生中可能發(fā)揮抑癌的作用。

圖 1 NSCLC細(xì)胞株和患者中TIF1γ的表達(dá)。A：實時定量PCR法檢測HBE、A549和95C細(xì)胞中TIF1γ mRNA水平的表達(dá)；B：Western blot檢測HBE、A549和95C細(xì)胞中TIF1γ蛋白的表達(dá)；C：用ImageJ灰度掃描軟件計算TIF1γ和GAPDH的表達(dá)，并用TIF1γ/GAPDH的值作為TIF1γ的相對表達(dá)量；D：實時定量PCR法檢測13對非小細(xì)胞肺癌組織與癌旁組織中TIF1γ mRNA的表達(dá)，每對癌組織與癌旁組織均取自同一個體。Fig 1 Expression of TIF1γ in NSCLC cell lines and NSCLC patients. A: The mRNA levels of TIF1γ and GAPDH in HBE, A549 and 95C were determined by quantitative RT-PCR; B: Representative Western blot of TIF1γ protein levels in HBE, A549 and 95C NSCLC cells; C: Relative estimation for TIF1γ expression in cell lines. ImageJ was used to evaluate the gray value of TIF1γ and GAPDH, and the ratio of TIF1γ/GAPDH was used as relative expression; D: Reletive expression of TIF1γ mRNA in human NSCLC tissues (T) and their paired normal lung tissue (N), each pair obtained from the same patient. NSCLC: non-small cell lung cancer.

DNA甲基化作為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的一種方式可通過影響癌基因或者抑癌基因的表達(dá)從而影響癌癥的發(fā)生。例如許多抑癌基因原本非甲基化的CpG島的超甲基化使得基因表達(dá)失活，從而誘發(fā)腫瘤[15]。因此研究抑癌基因的異常甲基化對于腫瘤的早期診斷具有重要的指導(dǎo)意義。本實驗首次研究了TIF1γ基因啟動子區(qū)域的甲基化與NSCLC之間的關(guān)系。在對TIF1γ基因啟動子-287--5區(qū)域的突變檢測表明在各細(xì)胞中-287--5區(qū)域并沒有發(fā)生突變，但經(jīng)BSP分析TIF1γ基因啟動子-287--5區(qū)域甲基化情況后，我們發(fā)現(xiàn)在-287--5區(qū)域里存在5個可被甲基化的CpG位點（-214、-128、-124、-65和-55），考慮到轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點上的CpG發(fā)生甲基化會阻礙轉(zhuǎn)錄因子的正確結(jié)合，從而影響基因轉(zhuǎn)錄，所以我們檢測了這5個CpG位點在HBE、A549和95C細(xì)胞中的甲基化頻率。盡管這5個CpG位點甲基化頻率在HBE、A549和95C細(xì)胞中并未見明顯差異，但這5個CpG位點的存在可以為其它細(xì)胞調(diào)控TIF1γ的表達(dá)提供可能途徑，因此其它細(xì)胞可能會通過TIF1γ基因啟動子區(qū)甲基化調(diào)控TIF1γ蛋白的表達(dá)。

圖 2 TIF1γ基因啟動子甲基化狀態(tài)。A：TIF1γ基因-287至-5區(qū)域CpG位點分布圖；B：TIF1γ基因-287至-5區(qū)域BSP測序代表圖。黑色箭頭：甲基化的CpG位點；C：HBE、A549和95C細(xì)胞中TIF1γ基因啟動子-287至-5區(qū)域經(jīng)BSP測序甲基化的CpG位點結(jié)果；：甲基化的CpG位點；：非甲基化的CpG位點。Fig 2 Methylation status of TIF1γ promoter. A: The distribution of CpG sites in the -287 to -5 region of TIF1γ promoter; B: Schematic representative of BSP for the promoter region from site -287 to -5 bp of the TIF1γ gene. Black arrow: methylated CpG sites; C: Results of methylated CpG sites in the -287 to -5 region of TIF1γ promoter in HBE, A549 and 95C cells by BSP-based sequencing; methylated CpG site;: Unmethylated CpG site.

圖 3 HBE、A549和95C細(xì)胞中TIF1γ基因啟動子-287至-5區(qū)域直接測序圖。Fig 3 Schematic representative of direct sequencing for the promoter region from site -287 bp to -5 bp of the TIF1γ gene in HBE, A549 and 95C cells.

TIF1γ影響TGF-β介導(dǎo)的生物學(xué)過程除了可通過依賴于Smad4的信號通路外還可以通過非依賴于Smad4的信號通路。在造血干細(xì)胞的生長分化過程中，TGF-β作為生長抑制因子可通過TGF-β/Smad通路抑制造血干細(xì)胞的生長，該過程包括p21蛋白的誘導(dǎo)生成。然而，TGF-β同樣可作為細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子通過下游的R-Smad與TIF1γ形成的復(fù)合物誘導(dǎo)造血干細(xì)胞的分化[8]。

目前為止， TIF1γ通過何種分子機制影響NSCLC的發(fā)生發(fā)展仍舊不是非常清楚。本研究我們分析了TIF1γ基因啟動子-287--5區(qū)域里的突變和甲基化情況對TIF1γ蛋白表達(dá)的影響，而對于其它可能機制并未研究。TIF1γ在NSCLC細(xì)胞和組織中的缺失可能涉及到其它表觀遺傳學(xué)上的改變?nèi)缃M蛋白的去乙?；蚱渌z傳結(jié)構(gòu)的改變，這有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，TIF1γ的表達(dá)減弱在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要的作用，TIF1γ基因啟動子-287--5區(qū)域存在5個可被甲基化的CpG位點，盡管這些CpG位點的甲基化頻率在NSCLC細(xì)胞株中相比HBE沒有明顯差異，但并不排除其它細(xì)胞可以通過這5個CpG位點的甲基化調(diào)控TIF1γ的表達(dá)。由于肺癌生物學(xué)特性非常復(fù)雜，惡性程度高，而且預(yù)后的效果差，因此我們必須尋找更加精確、有效的分子標(biāo)志物，以期更早的發(fā)現(xiàn)肺癌，TIF1γ或許可以為NSCLC的治療提供一個潛在的靶位點。