安娟 湯傳昊 王娜 劉毅 郭萬峰 李曉燕 王子赫 何昆 劉曉晴

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率上升速度高居各種腫瘤之首。據(jù)衛(wèi)生部2008年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國每年肺癌的發(fā)病人數(shù)約為70萬，2/3的患者發(fā)現(xiàn)時已失去手術(shù)根治機會。其中，占肺癌80%-90%的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者5年生存率僅為8%-15%[1]，但I期肺癌術(shù)后10年生存率可達到92%[2]。由此可見早診斷早治療是降低肺癌死亡率的關(guān)鍵所在。傳統(tǒng)的醫(yī)學診斷主要通過影像學檢查，盡管低劑量螺旋CT的應用相比胸部X線片提高了肺癌早診率，死亡率下降了20%[3]，然而，早期肺癌患者體內(nèi)潛在癌變的細胞克隆遠遠小于現(xiàn)今影像學測量技術(shù)可達的最小閾值，因此有必要尋找更早于影像學診斷的靈敏性和特異性更高的方法以提高肺癌的早期確診率。腫瘤蛋白質(zhì)組學從蛋白、肽段等更微觀的角度研究腫瘤，尋找腫瘤標志蛋白，進而闡明其表達水平的變化與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相互關(guān)系，在腫瘤早期診斷中極具潛力。其核心技術(shù)質(zhì)譜分析近年已逐漸應用于乳腺癌、胃癌、大腸癌等惡性腫瘤早期診斷的探索性研究[4-6]。本研究旨在應用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionizationtime of flight-mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）與納米磁珠提取血清多肽方法相結(jié)合--ClinProtTM系統(tǒng)，探索性分析NSCLC患者與健康人群的血清，從中篩選差異性多肽，通過統(tǒng)計學方法建立診斷NSCLC的分類模型并進行驗證，以期為建立NSCLC血清學診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源與收集 共收集了2011年8月-2012年10月在軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院肺部腫瘤科就診，經(jīng)病理證實為NSCLC的患者的血清標本（以下簡稱肺癌組）133例，所有病例均經(jīng)臨床檢查排除重要臟器（心、肝、腎等）疾病，血清標本在患者未進行任何治療時采集。同期收集了來自門診體檢正常的健康者的血清標本（以下簡稱健康組）132例，所有健康者肺部?？茩z查無異常，既往無肺部疾病病史。

標本收集步驟：①晨起8:00空腹采集外周靜脈全血3 mL置于EDTA抗凝試管；②常溫靜置2 h；③于4oC、1,500 r/min離心10 min；④取上清液（血清），每150 μL分裝一份，-80oC冰箱保存。

1.1.2 入組者基本情況 將133例NSCLC患者和132例健康者血清標本分別按3:1的比例隨機分為兩組：訓練組由100例NSCLC患者（以下簡稱肺癌組I）和100例健康者（以下簡稱健康組I）血清標本組成，用以建立分類模型；測試組由33例NSCLC患者（以下簡稱肺癌組II）和32例健康者（以下簡稱健康組II）血清標本組成，用以驗證模型。訓練組與測試組患者在年齡、性別、吸煙情況、組織學類型及臨床分期等方面均無統(tǒng)計學差異?；颊呒敖】嫡呋厩闆r見表1。

1.1.3 試劑和儀器 三氟乙酸（trifluoroacetic acid, TFA）（美國Sigma公司）；乙腈（acetonitrile，CAN，美國Fisher公司）；α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA）和混合標肽（Bruker公司）；銅離子螯合納米磁珠（MB-IMAC-Cu2+）及其緩沖液體系（國家生物醫(yī)學分析中心）；MALDI-TOF-MS（Ultraflex）、 MTP-Anchorpchip 靶（Var/384）、磁珠分離器（magnetic bead separator, MBS）、分析軟件ClinProTools 2.1均為Bruker公司產(chǎn)品；離心機（LDZ5-2，北京離心機廠）。

表 1 患者及健康者基本情況Tab 1 Basic information of patients and healthy human

1.2 磁珠提取血清多肽及質(zhì)譜檢測 將MB-IMAC-Cu2+混勻，取5 μL磁珠及50 μL結(jié)合液加入Eppendorf管，放在MBS上移動4次，棄去上清液，并重復3次；再加入20 μL結(jié)合液和 5 μL血清，混勻，室溫下靜置10 min，編號；將Eppendorf管放在MBS上移動4次，除去上清液；加入100 μL洗滌液，在MBS上移動4次，棄去上清液；再加入100 μL洗滌液，在MBS上移動4次，棄去上清液，此步驟重復2次；加入20 μL洗脫液，混勻，室溫靜置20 min，將Eppendorf管放置在MBS上移動4次后靜置20 s，將上清液移至新的Eppendorf管內(nèi)，得到血清多肽，編號。

將1 μL提取的血清多肽與1 μL飽和HCCA基質(zhì)（用含0.1%TFA、50%CAN溶解）混勻，點在靶板上，室溫干燥；將靶板放入質(zhì)譜儀； 用標準品校正儀器后，檢測標品，獲得由不同質(zhì)荷比（mass-to-charge ratio, m/z）的多肽峰構(gòu)成的質(zhì)譜圖。

為了避免系統(tǒng)誤差以及人為操作的失誤，在每次標本檢測前均會使用標準品（多肽混合物）進行檢測，當檢測結(jié)果與標準品組成一致，說明試驗系統(tǒng)正常時才會進行標本的檢測，從而保證實驗結(jié)果可靠以及可重復性。

同時，為了說明系統(tǒng)穩(wěn)定性，隨機抽取肺癌組和健康組血清標本各10例，每例每一次取血清5 μL，用于連續(xù)6天以及1天內(nèi)連續(xù)6次的磁珠提取和質(zhì)譜實驗。選取m/z范圍在1,000 Da-10,000 Da的峰計算變異系數(shù)，結(jié)果顯示日間和日內(nèi)變異系數(shù)均小于20%。

1.3 統(tǒng)計學分析 血清多肽經(jīng)MB-IMAC-Cu2+提取后，通過MALDI-TOF-MS進行線性模式檢測，所獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過 ClinProToolTM（CPT）軟件進行統(tǒng)計學分析，在用CPT軟件正式分析前先對樣品原始質(zhì)譜圖進行處理，包括基線消減、校正和歸一化。隨后，將作為訓練組的100例NSCLC患者和100例健康者的血清多肽譜，用軟件內(nèi)嵌的統(tǒng)計算法進行統(tǒng)計學分析，獲得兩組間的差異表達多肽，然后由統(tǒng)計軟件優(yōu)選出其中3個多肽（7,478.59 Da、2,271.44 Da、4,468.38 Da）建立診斷NSCLC的分類模型。模型通過分析這3個多肽在每例標本中的峰面積大小，判斷該標本來源于肺癌患者或健康者。最后再用測試組的33例NSCLC患者和32例健康者通過分類模型進行盲樣驗證，以檢驗模型的穩(wěn)定性和可靠性。

2 結(jié)果

2.1 訓練組的血清多肽指紋圖譜 訓練組納入100例NSCLC患者和100例健康者，應用MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測訓練組的血清多肽磁珠提取物，得到肺癌組I和健康組I的血清多肽指紋圖譜，結(jié)果見圖1。

2.2 訓練組的血清差異多肽結(jié)果分析

2.2.1 肺癌相關(guān)差異表達多肽的發(fā)現(xiàn) 肺癌組I和健康組I的血清多肽指紋圖譜經(jīng)CPT軟件分析后共鑒定出多肽峰131個。定義兩組間P＜0.000,001、AUC≥0.9的多肽峰具有統(tǒng)計學差異，由此找到兩組m/z在1,000 Da-10,000 Da范圍內(nèi)表達的差異多肽峰14個，具體結(jié)果見表2。

表 2 訓練組差異多肽質(zhì)荷比及表達變化Tab 2 m/z and expression change of training group

2.2.2 NSCLC分類模型的建立 通過CPT軟件的聚類分析方法（圖2）對肺癌組I與健康組I的血清多肽指紋圖譜進行對比分析，得到監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法（supervised neural network, SNN）為最優(yōu)算法，該算法是以原型為基礎(chǔ)的分組算法，是以Kohonen’s學習型向量量化器的觀點為基礎(chǔ)，從監(jiān)督相關(guān)的神經(jīng)氣體算法[7]改進而來。其工作方式為：①依據(jù)Batch-Neural-Gas算法將預先定義的原型（分組）數(shù)分布于數(shù)據(jù)中，進而根據(jù)數(shù)據(jù)密度屬性建立原型的最優(yōu)分布；②隨后根據(jù)分組信息優(yōu)化原型數(shù)在數(shù)據(jù)中的分布，同時將經(jīng)驗性錯誤最小化。該算法結(jié)果顯示最優(yōu)模版由3個多肽組成，其質(zhì)荷比分別為7,478.59 Da、4,468.38 Da、2,271.44 Da（圖3）。以該模版建立分類模型，定義當某血清多肽圖中其7,478.59 Da峰面積在（3.85±1.42）范圍、4,468.38 Da峰面積在（434.41±157.85）范圍、2,271.44 Da峰面積在（12.01±4.28）范圍時，該血清來源于肺癌患者；而血清多肽圖中7,478.59 Da峰面積在（11.55±3.78）范圍、4,468.38 Da峰面積在（150.05±51.41）范圍、2,271.44 Da峰面積在（37.7±23.8）范圍時，該血清來源于健康者。結(jié)果得到該模型對肺癌的識別率為98.04%，預測能力為99.07%。

2.3 盲法鑒定 對納入測試組的33例肺癌患者和32例健康者血清，采取同樣的CPT軟件獲得其血清多肽指紋圖譜，并運用SNN算法建立的模型進行驗證，33例肺癌患者和31例健康對照被準確判斷（其中33例肺癌患者全部判斷正確，32例健康者中有1例判斷假陽性，其它都判斷正確）。通過盲樣驗證，該模型的準確率為98.5%，特異性為96.9%，敏感性為100%。

3 討論

質(zhì)譜分析是腫瘤蛋白質(zhì)組學的核心檢測技術(shù)，目前常用的生物質(zhì)譜包括： MALDI-TOF-MS、電噴霧質(zhì)譜（electrospray ionization-mass spectrometry, ESI-MS）、表面加強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（surface-enhanced laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry, SELDITOF-MS）等。其中MOLID-TOF-MS具有耐鹽和耐污染物的能力高、靈敏度高的特點，在儀器中引入反射技術(shù)和延遲提取技術(shù)后，儀器的分辨率大大提高，在測定2,000 Da左右的小分子多肽時，準確度可達到 10 ppm以下。

圖 1 訓練組的血清多肽圖譜。A：肺癌組I；B：健康組I。Fig 1 Serum peptide profiles of training group. A: NSCLC I; B: Healthy I.

圖 2 血清多肽圖的聚類分析（紅色：肺癌組I；綠色：健康組I）Fig 2 Clustering analysis of MS-based serum peptide profiles (red:NSCLC I; green: Healthy I)

圖 3 建模的3個多肽峰（紅色：肺癌組I；綠色：健康組I）Fig 3 Specific peptide peaks of model (red: NSCLC I;green: Healthy I)

鑒于質(zhì)譜在鑒定蛋白質(zhì)方面具有高敏感、高通量等優(yōu)勢，近年來很多研究者嘗試通過質(zhì)譜檢測來早期診斷腫瘤。其主要方法是通過對腫瘤患者與健康人群的標本進行質(zhì)譜分析，從而發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性蛋白或多肽。Monari等[8]用IMAC30-Cu和H50的SELDI芯片對44例NSCLC患者和19例正常人研究，發(fā)現(xiàn)兩組間存在28個明顯差異峰，遂建立模型，用IMAC30-Cu芯片得到的敏感性和特異性分別是70.45%和68.42%，而H50芯片分別是72.73%和73.68%。Han等[9]用金屬親和蛋白芯片和SELDITOF技術(shù)研究血清標本，利用3個蛋白質(zhì)建立樹狀模型，盲樣驗證敏感性為89%、特異性為91%、準確率為90%。Hocker等[10]采用ESI-MS對43例早期NSCLC患者和21例對照者的血清標本進行分析，鑒定的差異蛋白區(qū)分患者及健康者血清的總體有效率和靈敏度為80%和84%。這些研究結(jié)果說明質(zhì)譜檢測方法有能力識別肺癌患者血清里所含有的腫瘤相關(guān)信息，有可能進行肺癌的早期診斷。但上述研究盲樣驗證的敏感性和特異性均較低，且沒有后續(xù)研究進一步驗證。分析其原因為：①在傳統(tǒng)的方法中，無論是雙向凝膠電泳、蛋白芯片還是固相萃取小柱等預處理技術(shù)提取標本中的蛋白和多肽，均存在操作復雜且提取效率較低的缺點，導致可用信息丟失；②ESI、SELDI-TOF-MS等質(zhì)譜檢測方法靈敏度和分辨率較低，反映的信息較少。以上限制阻礙了它們在疾病特異性標志物的發(fā)現(xiàn)和臨床診斷上的應用。

為了解決上述問題，本研究組應用了德國布魯克·道爾頓公司研發(fā)的ClinProtTM檢測系統(tǒng)[11,12]。它包括磁珠分離系統(tǒng)、MALDI-TOF-MS系統(tǒng)、分析軟件和可選的體液樣品自動處理系統(tǒng)，其優(yōu)勢在于：①擁有最新Anchor-Chip專利技術(shù)的樣品靶可大大增加分析物的濃度，較常規(guī)芯片提高10倍-100倍的靈敏度；②MALDI技術(shù)的分辨率與重復性、重現(xiàn)性均高于SELDI或其它質(zhì)譜技術(shù)；③液體磁珠總表面積大，能充分捕獲血清中特異低豐度多肽信息，提高了模型的特異性和準確性；④水熱法制備金屬螯合納米磁珠[13]系統(tǒng)配合了一套適合于質(zhì)譜分析的緩沖溶液，整個實驗體系穩(wěn)定、可靠，實現(xiàn)了樣品微量化，分析過程快速化、通量化、標準化。在哈佛大學女子醫(yī)院、紐約斯隆-凱特琳癌癥研究所、貝勒醫(yī)學院等世界一流醫(yī)院和醫(yī)學研究所中，該技術(shù)已廣泛應用于卵巢癌、腦膠質(zhì)瘤、頭頸鱗癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌[14,15]等的早期診斷研究中，而在本研究中，我們通過ClinProtTM檢測系統(tǒng)對NSCLC患者和健康者血清進行了檢測，兩組間發(fā)現(xiàn)14個有統(tǒng)計學差異的多肽峰，遂以統(tǒng)計軟件篩選出3個多肽峰建立NSCLC分類模型，并對其進行盲樣驗證，其敏感性為100%，特異性為96.9%，準確率為98.5%，說明我們建立的分類模型理論上具有一定的鑒別NSCLC患者的價值，但尚需在臨床實踐中進一步證實。

關(guān)于我們建立的分類模型，它不像傳統(tǒng)診斷模式那樣以單一指標為判斷依據(jù)，而是以一組多肽指標為判斷標準。它以生物質(zhì)譜技術(shù)為支撐平臺，生物信息學為橋梁，對多肽表達進行研究，通過肺癌患者血液中多肽組的變化，可以發(fā)現(xiàn)特異的腫瘤相關(guān)信息以達到對腫瘤的診斷。當血液流經(jīng)腫瘤微環(huán)境時，血清蛋白/多肽組中可能產(chǎn)生許多輕微的未知組分的變化，因此，使用復合的標志物可以較單個標志物更為有效。通過MALDI-TOF分析的血清質(zhì)譜圖需要數(shù)字化并經(jīng)成熟的生物信息工具軟件來診斷分析，通過與機體在正常條件下的質(zhì)譜圖進行比較，從而鑒別腫瘤患者和非腫瘤患者。它可在數(shù)分鐘內(nèi)從微量血液中測出上萬個結(jié)果并對其進行分析，理論上這種分類模型在腫瘤診斷中有望超越傳統(tǒng)的標志物檢測。

本研究中建立分類模型的3個多肽峰，數(shù)據(jù)庫檢索顯示其中m/z為2,271.44的多肽峰可能代表間α胰蛋白酶重鏈H4（inter-α-trypsin inhibitor H4, ITIH4）。查閱文獻，間α胰蛋白酶重鏈（inter-α-trypsin inhibitor, ITIH）基因是一種抑癌基因[16]，包括ITIH1-ITIH5，其中ITIH4定位于3號染色體短臂，對血漿激肽釋放酶高度敏感，被認為是潛在的血漿激肽釋放酶誘導的生物肽前體。它主要在炎癥和癌癥發(fā)生方面起重要作用[17]。有研究[18]發(fā)現(xiàn)ITIH4在卵巢癌血清中表達下降。也有研究[19,20]認為ITIH4是乳腺癌的腫瘤標志物，在乳腺癌患者血清中表達上調(diào)，有助于診斷和判斷預后 。但有關(guān)肺癌的報道較少，Hamm等[17]發(fā)現(xiàn)在52%的肺癌組織中ITIH4 mRNA表達量下降。本研究結(jié)果亦顯示在血清多肽圖譜中該多肽峰表達下調(diào)，其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制及其作為診斷標志物的價值還有待進一步研究。

本研究選用NSCLC患者以及健康者的血清作為研究對象，應用ClinProtTM系統(tǒng)的MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測血清多肽，對特異的NSCLC相關(guān)多肽小規(guī)模驗證，得到了相對較高的敏感性和特異性。由于我們收集的標本主要來源于IV期患者且多為腺癌患者，以后將納入更多的I期患者標本甚至動態(tài)監(jiān)測高危人群的標本，以及鱗癌等其它組織學類型的NSCLC標本，進一步驗證該診斷模型的敏感性和特異性。用于NSCLC診斷的特異血清多肽譜模型，具有無創(chuàng)、標本量需求少、簡便、快捷、準確性高等優(yōu)勢，下一步我們需要在臨床實際工作中進行大規(guī)模驗證，希望為建立NSCLC血清學診斷方法奠定基礎(chǔ)。