張喜悅 ，呼西旦，曹 瑞 ，杜鵬飛 ，努爾拜合提 ，古努爾·吐?tīng)栠d ，孫照剛 ，范偉興

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.新疆牧科院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000； 3.北京市胸部腫瘤結(jié)核病醫(yī)院，北京 101149）

牛結(jié)核病主要是由牛結(jié)核分枝桿菌引起的一種人畜共患病[1]，大多數(shù)牛不呈顯性感染或僅到晚期才出現(xiàn)臨床癥狀，故臨床診斷不易獲得準(zhǔn)確結(jié)果。目前常用的牛結(jié)核檢疫方法有變態(tài)反應(yīng)等免疫學(xué)方法，但在發(fā)達(dá)國(guó)家，仍然以細(xì)菌的分離和鑒定作為牛結(jié)核診斷方法的金標(biāo)準(zhǔn)[2-5]。我國(guó)在牛結(jié)核分枝桿菌的分離和鑒定上研究較少，這也成立制約我國(guó)確診牛結(jié)核病例的關(guān)鍵因素。

傳統(tǒng)的牛結(jié)核分枝桿菌鑒定方法主要包括細(xì)菌形態(tài)、染色特性和生化鑒定等，這些鑒定方法操作較為復(fù)雜且需時(shí)較長(zhǎng)。隨著結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和多種非典型分枝桿菌的序列測(cè)定完畢，很多科學(xué)家通過(guò)比較基因組學(xué)設(shè)計(jì)引物，利用多重PCR方法快速鑒定結(jié)核分枝桿菌。如Wilton等建立了可以鑒定多種分枝桿菌的分枝桿菌多重PCR[6]，Richard等建立可以區(qū)分牛結(jié)核分枝桿菌和人結(jié)核分枝桿菌的結(jié)核分枝桿菌群（MTC）PCR方法[7]。我們?cè)跈z疫出結(jié)核陽(yáng)性牛并撲殺后，采集了病料進(jìn)行細(xì)菌分離，然后進(jìn)行多重PCR快速鑒定為牛結(jié)核分枝桿菌感染。

1 材料與方法

1.1 酶類、培養(yǎng)基和引物

Taq DNA聚合酶（5U/μL）、PCR Master等購(gòu)自大連寶生物公司；DNA Marker 、EB（溴化乙錠）（100kb DNA ladder）等購(gòu)自Promega公司。Middle brook 7H11培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)BD公司。按照表1所示序列，PCR引物由大連寶生物公司合成。

表1 合成的引物序列

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株M.bovis（ATCC 55235）均由北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所細(xì)菌免疫研究實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 結(jié)核陽(yáng)性牛的撲殺

利用比較變態(tài)反應(yīng)和伽馬干擾素試驗(yàn)檢疫牛群，抽檢在2種方法中均為陽(yáng)性的牛撲殺，觀察陽(yáng)性牛的結(jié)核病變。

1.4 分枝桿菌的培養(yǎng)

無(wú)菌條件下，采集結(jié)核病變，加入適量的滅菌生理鹽水，經(jīng)研磨器勻漿處理后，加入2倍體積的4%硫酸，室溫下處理病料15～20 min。利用生理鹽水再將處理過(guò)的病料做10倍稀釋，用移液器分別接種0.2 mL至Middle brook 7H11 培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)6周，觀察結(jié)果。

1.5 分離菌株的滅活與染色鑒定

將初次培養(yǎng)的結(jié)核菌落再次接種到Middle brook 7H11 培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)。分別將擴(kuò)大培養(yǎng)好的臨床分離菌株和牛結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株轉(zhuǎn)移到密閉的含有生理鹽水的試管中，將試管置于水浴鍋，經(jīng)80℃ 2h滅活。用分枝桿菌特異性Ziehl-Neelsen（Z-N）方法染色，于顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6 分離菌株的分枝桿菌多重PCR鑒定

1.6.1 分枝桿菌多重PCR方法 以滅活的分離菌株作為樣品，以牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株作為陽(yáng)性對(duì)照，用 Mycgen、 TB1 、Mycav和 Mycint 4對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL：樣品2 μL，4對(duì)引物（Mycgen、TB1、Mycav和Mycint）的上下游引物各 1 μL，PCR Master 10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋貉h(huán) 1：94℃ 10min，61℃ 2min，72℃ 3min，1個(gè)循環(huán)；循環(huán)2：94℃ 1min，61℃ 2min，72℃3min，33個(gè)循環(huán)；循環(huán)3，94℃10min，61℃ 2min，72℃ 3min，1個(gè)循環(huán)后置4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取5μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.6.2 分枝桿菌多重PCR判定標(biāo)準(zhǔn) 引物MYCGEN-F和MYCGEN-R擴(kuò)增出1030bp片段表明為分枝桿菌種；TB1-F和TB1-R擴(kuò)增出372bp片段，表明為MTC群（包括人分枝桿菌和牛分枝桿菌等）；MYCA－F和MYCA－R擴(kuò)增出180bp片段，表明為禽分枝桿菌，MYCINT-F和MYCINT-R擴(kuò)增出850bp片斷，表明為胞內(nèi)分枝桿菌。

1.7 臨床分離株的MTC PCR鑒定

1.7.1 MTC PCR方法 以滅活的分離菌株作為樣品，分別用16S RNA、Rv0577、IS1561、Rv1510和Rv1970 5對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。每對(duì)引物的反應(yīng)體系為20μL：樣品2 μL，每對(duì)引物的上下游引物各1 μL，PCR Master 10μL，不足部分用水補(bǔ)齊。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min初次變性，然后94℃變性1 min 、60℃ 退火 1 min、72℃ 延伸 1 min，共經(jīng)35個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸10 min結(jié)束反應(yīng)，并于4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。取5μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.7.2 MTC PCR判定標(biāo)準(zhǔn) MTC群內(nèi)定型多重PCR中，對(duì)于人結(jié)核分枝桿菌，5對(duì)引物均有產(chǎn)物擴(kuò)增，而牛結(jié)核分枝桿菌僅有16S RNA、Rv0577和IS1561 3對(duì)引物擴(kuò)增，而引物Rv1510和Rv1970則無(wú)擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 病理解剖結(jié)果

利用比較變態(tài)反應(yīng)和伽馬干擾素試驗(yàn)檢疫牛群，抽檢在2種方法中均為陽(yáng)性的牛撲殺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了明顯的結(jié)核病變，在肺部形成大小不等的結(jié)核結(jié)節(jié)，多數(shù)為珍珠樣大小，但也有呈雞蛋大的結(jié)節(jié)。將結(jié)節(jié)切開(kāi)后，可見(jiàn)內(nèi)有明顯的干酪樣壞死（圖1）。

圖1 充滿干酪樣壞死的雞蛋大結(jié)節(jié)

2.2 細(xì)菌分離結(jié)果

將結(jié)節(jié)內(nèi)的干酪樣壞死取出，勻漿后經(jīng)酸處理，接種于Middle brook 7H11培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)6周，可見(jiàn)有不透明的顆粒狀菌落生長(zhǎng)，表面皺褶粗糙，呈乳白色結(jié)節(jié)狀，證實(shí)分離菌株生長(zhǎng)良好。將分離菌株再次接種到Middle brook 7H11培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)6周。

2.3 染色鑒定結(jié)果

滅活后的臨床分離菌株經(jīng)分枝桿菌特異性Ziehl-Neelsen（Z-N）方法染色后，于高倍顯微鏡下（500倍）觀察，可見(jiàn)有呈紅色的火柴棒樣細(xì)長(zhǎng)桿菌，呈排列無(wú)序，因此可以高度懷疑其為分枝桿菌（圖2）。

圖2 分離菌株的Ziehl-Neelsen染色結(jié)果

2.4 分枝桿菌多重PCR鑒定結(jié)果

以滅活的分離菌株作為樣品，以牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株作為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行分枝桿菌多重PCR。反應(yīng)結(jié)束后取5μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察。結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照成立，而臨床樣品分離菌株同牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株一樣，引物MYCGEN-F和MYCGEN-R有1030bp片段擴(kuò)增，引物TB1-F和TB1-R有372bp片段擴(kuò)增。證實(shí)分離菌株屬于MTC群（圖3）。

圖3 MTC群多重PCR鑒定結(jié)果

2.5 MTC PCR

以滅活的分離菌株作為樣品，用16S RNA、Rv0577、IS1561、Rv1510和Rv1970 5對(duì)引物進(jìn)行MTC群內(nèi)多重PCR。擴(kuò)增結(jié)束后取5μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察。結(jié)果分離菌株在16S rRNA、 Rv0577和IS1561 3對(duì)引物處有擴(kuò)增，片段大小依次為543bp、786bp和943bp，而 Rv1510和Rv1970 2對(duì)引物則無(wú)擴(kuò)增，因此將分離菌株鑒定為牛結(jié)核分枝桿菌（圖4）。

3 討論

3.1 細(xì)菌分離的重要性

圖4 臨床分離株的MTC群內(nèi)定型多重PCR鑒定結(jié)果

發(fā)達(dá)國(guó)家最后確診牛結(jié)核病的最終依據(jù)仍然是細(xì)菌分離[2-5]。但由于我國(guó)沒(méi)有結(jié)核陽(yáng)性牛撲殺后必須進(jìn)行細(xì)菌分離的規(guī)定，而且國(guó)內(nèi)缺乏與牛結(jié)核相關(guān)的生物安全實(shí)驗(yàn)室和培養(yǎng)方法不科學(xué)等諸多原因，導(dǎo)致我國(guó)在牛結(jié)核分枝桿菌的分離和鑒定上研究較少。我們采集了臨床上的牛結(jié)核結(jié)節(jié)，在我國(guó)人結(jié)核參比實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用營(yíng)養(yǎng)豐富的Middle brook 7H11培養(yǎng)基，最終大量培養(yǎng)了牛結(jié)核分枝桿菌，這也為我國(guó)能夠最終確診牛結(jié)核奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3.2 非特異性分枝桿菌對(duì)牛結(jié)核細(xì)菌分離的干擾

我國(guó)的很多變態(tài)反應(yīng)結(jié)核陽(yáng)性牛，臨床上無(wú)任何臨床癥狀，撲殺后也沒(méi)有可見(jiàn)的病理變化，這在很大程度上是由于非特異性分枝桿菌的感染引起的[8，9]。牛場(chǎng)中往往存在有大量的沒(méi)有致病性的非特異性分枝桿菌。如草分枝桿菌等不會(huì)引起任何動(dòng)物發(fā)??；禽分枝桿菌雖然能夠引起禽發(fā)病，但牛感染后并不表現(xiàn)任何癥狀，也不會(huì)傳染給人，而且人類只有在缺乏免疫力如患有艾滋病等的情況下才會(huì)感染禽分枝桿菌，因此發(fā)達(dá)國(guó)家并不撲殺禽結(jié)核陽(yáng)性牛[2-5]。但這些非特異分枝桿菌感染牛后，不僅干擾變態(tài)反應(yīng)檢疫，還會(huì)干擾牛結(jié)核細(xì)菌分離的準(zhǔn)確性。因此臨床菌株分離后，必須要并對(duì)其進(jìn)行鑒定，以排除非特異性分枝桿菌的干擾。

3.3 關(guān)于MTC群內(nèi)定型多重PCR

牛結(jié)核病在很多情況下也可以由人分枝桿菌引起，而且很難通過(guò)生化試驗(yàn)等傳統(tǒng)方法進(jìn)行鑒別。分枝桿菌的比較基因組學(xué)分析顯示，不同分枝桿菌基因組的缺失區(qū)域（RD）有明顯不同，如RD7區(qū)在人結(jié)核分枝桿菌中存在但在牛型分枝桿菌中則缺失，因此可以針對(duì)這些區(qū)域建立PCR方法以鑒別牛結(jié)核分枝桿菌和人結(jié)核分枝桿菌[7]。本試驗(yàn)中的臨床分離株的擴(kuò)增結(jié)果與牛結(jié)核分枝桿菌完全一樣，因此將其鑒定為牛結(jié)核分枝桿菌。

[1]世界動(dòng)物衛(wèi)生組織.哺乳動(dòng)物、禽、蜜蜂A和B類疾病診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004：399-410.

[2]羅伯特.澳大利亞根除牛布魯氏菌病和結(jié)核病紀(jì)實(shí)[S].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007：87-108.

[3]Faye S， Moyen J L， Gares H， et al.Determination of decisional cut-off values for the optimal diagnosis of bovine tuberculosis with a modified IFNγ assay （Bovigam?） in a low prevalence area in France[J].Vet Microbiol， 2011，151（1/2）：60-67.

[4]Whelan A O， Clifford D， Upadhyay B， et al.Development of a skin test for bovine tuberculosis for differentiating infected from vaccinated animals[J].J Clin Microbiol， 2010， 48（9）：3176-3181.

[5]Liebana E， Johnson L， Gough J， et al.Pathology of naturally occurring bovine tuberculosis in England and Wales[J].Vet J， 2008， 176（3）：354-360.

[6]Wilton S， Cousins D.Detection and identification of multiple mycobacterial pathogens by DNA amplification in single tube [J].PCR Methods Appl， 1992， 1（4）：269-273.

[7]Huard R C， Lazzarini L C， Butler W R， et al.PCR-based method to differentiate the subspecies of the Mycobacterium tuberculosis complex on the basis of genomic deletions [J].J Clin Microbiol， 2003， 41（4）：1637-1650.

[8]高云航，何昭陽(yáng)，單曉楓，等.ELISA檢測(cè)牛結(jié)核抗體時(shí)假陽(yáng)性反應(yīng)的消除[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2004， 24（5）：419-420.

[9]李金嶺，郭宏軍， 高明輝， 等.歐盟皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)比較試驗(yàn)法結(jié)合ELISA檢測(cè)牛結(jié)核病的研究 [J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2007， 24（7）：28-29.