郁 磊，吳 娟，朱 軍，朱國強(qiáng)*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210095；3.南京天邦生物科技有限公司，江蘇南京211102)

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起仔豬腹瀉的主要病原之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。ETEC首先通過特異性粘附素吸附到小腸粘膜上皮細(xì)胞表面的受體上，并定植于腸表面[1]。不同ETEC的菌毛粘附素類型不同，主要有K88、K99、987P及F41，其中以K88的流行最為普遍，因而也尤為重要[2-3]。從分子水平研究病原菌粘附素與宿主細(xì)胞表面大分子受體相互作用，才能最直接、最有效地阻止病原菌侵入機(jī)體細(xì)胞[4]，這是當(dāng)前病原菌預(yù)防和控制研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，而粘附素的體外表達(dá)和功能性分析則是開展上述研究的前提和基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)室已于2008年克隆出K88ac菌毛操縱子中除faeA、faeB調(diào)節(jié)基因之外的操縱子結(jié)構(gòu)基因，實(shí)現(xiàn)K88ac菌毛蛋白在非致病性且不含任何菌毛的E.coli中體外高效表達(dá)，并以其表達(dá)純化產(chǎn)物制備了多抗血清[5]。本實(shí)驗(yàn)利用類似的方法克隆出K88菌毛的K88ab和K88ad菌毛操縱子fae全基因，使這兩個(gè)血清型的菌毛蛋白在非致病性且不含任何菌毛的E.coli中體外高效表達(dá)，并比較表達(dá)3種不同血清型K88菌毛的野生菌以及重組菌與豬腸道上皮細(xì)胞系IPEC-J2的黏附性，為從分子水平上研究K88菌毛與宿主細(xì)胞表面大分子受體相互作用、進(jìn)一步比較K88菌毛三種血清型的不同生物學(xué)特性、探索K88菌毛的功能以及在ETEC菌致病過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞系 K88ab、K88ac和K88ad 3種血清型E.coli參考株分別為C83901株、C83902株和C83903株，購自中國獸藥監(jiān)察所菌種保藏中心；表達(dá)載體pBR322購自NEB公司；E.coli DH5α和SE5000均由本實(shí)驗(yàn)室保存；K88ac重組菌SE5000(pBR322-K88ac)、鼠抗重組K88ac菌毛血清和鼠抗K88ac菌毛單克隆抗體(MAb)由本實(shí)驗(yàn)室制備；豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2由美國Kansas州立大學(xué)Dr.Schultz惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑 Expand Long Template PCR System購自Roche公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自 NEB公司；DNA Marker DL2000、λHin dⅢ購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)購自BBI(Bio basic inc)公司；低分子量蛋白Marker和羊抗鼠IgG-HRP購自博士德公司。

1.3 K88fae基因的克隆與重組表達(dá)

1.3.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中登錄的fae操縱子各結(jié)構(gòu)基因序列,用DNAStar軟件分析設(shè)計(jì)擴(kuò)增K88fae全長的一對引物，并在上下游引物的5'末端分別加上相應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)，引物由上?；瞪锕こ坦竞铣?。

1.3.2PCR擴(kuò)增與檢測按全菌裂解法制備ETEC K88ab參考株C83901和K88ad參考株C83903染色體DNA為模板[6]，Expand Long Template PCR System擴(kuò)增目的基因：94℃2min，94℃15s、56℃30s、68℃8m in，共25個(gè)循環(huán)；68℃8m in。PCR產(chǎn)物與載體pGEM-T連接，并轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，對重組質(zhì)粒pGEM-fae進(jìn)行測序鑒定。

1.3.3重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定凝膠回收雙酶切處理后的pBR322和目的基因K88fae PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pBR-K88ab和pBR-K88ad。

1.3.4目的蛋白的表達(dá)將pBR-K88ab和pBR-K88ad分別轉(zhuǎn)化SE5000菌。重組菌pBR-K88ab/SE5000、pBR-K88ad/SE5000接種于氨芐抗性TSB液體培養(yǎng)基中，同時(shí)將ETEC K88ab C83901和K88ad C83903參考株接種TSB液體培養(yǎng)基作為陽性對照，37℃振蕩培養(yǎng)24h，用熱抽提法結(jié)合飽和硫酸銨沉淀[7]分離重組菌和參考株菌體表面表達(dá)的菌毛。

1.4 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

1.4.1玻板凝集試驗(yàn)取重組菌SE5000(pBRK88ab)、SE5000(pBR-K88ad)和 ETEC K88ab 參考株C83901、K88ad參考株C83903TSB過夜培養(yǎng)物分別與鼠抗重組K88ac菌毛血清抗K88ac菌毛MAb進(jìn)行玻板凝集試驗(yàn)。

1.4.2電鏡觀察K88重組菌靜止培養(yǎng)24h后經(jīng)PBS緩沖液洗滌兩次，吸取少量菌液浮于銅網(wǎng)，磷鎢酸負(fù)染5m in，Philips Tecnai12-tw in透射電鏡下觀察并拍照。同時(shí)設(shè)K88參考株和含pBR322空載體的SE5000菌為陽性和陰性對照。

1.5 表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性鑒定

1.5.1SDS-PAGE和western blot鑒定取純化菌毛按文獻(xiàn)方法[7]進(jìn)行western blot試驗(yàn)，10%BSA 4℃封閉過夜。以1∶1000稀釋的K88菌毛MAb為一抗，1∶50稀釋的羊抗鼠IgG-HRP為二抗，DAB底物顯色。同時(shí)設(shè)K88ab、K88ad參考株的純化菌毛為陽性對照。

1.5.2小腸上皮細(xì)胞黏附和黏附抑制試驗(yàn)在96孔板中培養(yǎng)的IPEC-J2細(xì)胞單層中，每孔細(xì)胞數(shù)約8×104，用PBS洗滌3次后，以感染復(fù)數(shù)(MOI)1∶100加入細(xì)菌，共同孵育2h后，PBS洗滌3次，以0.5%Triton X-100作用20min，分散并收集細(xì)菌懸液并進(jìn)行倍比稀釋，涂布于LB平板，37℃過夜培養(yǎng)，CFU記數(shù)。含pBR322空載體的大腸桿菌SE5000為陰性對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。黏附抑制試驗(yàn)將鼠抗重組K88菌毛多克隆抗體血清與待檢細(xì)菌等量混和，37℃孵育30m in，與單層IPEC-J2細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞黏附試驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 K 88fae基因的PCR擴(kuò)增 利用設(shè)計(jì)的引物以ETEC K88ab參考株C83901和K88ad參考株C83903基因組DNA為模板均擴(kuò)增出特異性目的條帶，其片段大小與預(yù)期相符，為7.9kb左右(圖1)。將該P(yáng)CR片段克隆至pGEM-T質(zhì)粒中，測序結(jié)果表明，篩選獲得陽性重組質(zhì)粒，其fae基因序列與已發(fā)表的fae操縱子各結(jié)構(gòu)基因序列基本一致。

2.2 K88fae基因的表達(dá) 分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pBR-K88ab、pBR-K88ad，并將其分別轉(zhuǎn)化于E.coli SE5000菌中，重組菌接種于含氨芐的TSB中，37℃培養(yǎng)過夜后能與鼠抗重組K88ac菌毛血清、鼠抗K88ac菌毛MAb產(chǎn)生明顯的玻板凝集反應(yīng)。經(jīng)負(fù)染的重組菌在透射電鏡下可見細(xì)胞表面布滿菌毛，對比K88+參考株C83901、C83903可見其菌毛致密，細(xì)長，確認(rèn)重組菌中菌毛表達(dá)較好，而陰性對照未見菌毛。

2.3 重組表達(dá)菌毛SDS-PAGE和western blot分析 熱抽提分離純化的K88ab、K88ad菌毛經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在26ku處有明顯條帶，與faeG主要結(jié)構(gòu)蛋白亞單位26ku報(bào)道一致[8]。經(jīng)western blot分析，1∶1000稀釋的K88菌毛MAb能夠特異性識(shí)別K88ab、K88ad重組菌的主要結(jié)構(gòu)蛋白條帶(圖 2)。

2.4 仔豬小腸上皮細(xì)胞黏附試驗(yàn)和黏附抑制試驗(yàn)細(xì)胞黏附試驗(yàn)結(jié)果顯示，表達(dá)K88菌毛3種血清型的重組菌和K88+參考株均能很好的黏附于IPEC-J2上皮細(xì)胞(圖3)。當(dāng)以1∶100MOI在 IPEC-J2單層細(xì)胞加入7×106cfu細(xì)菌，共同孵育2h后，同一血清型的重組菌株比參考株每孔黏附細(xì)菌數(shù)多20%～30%，其中K88ac血清型黏附數(shù)最多，K88ab次之，K88ad最少；而陰性對照菌每孔僅檢測到2×103cfu，為K88ac重組菌的1/160。而上述K88+參考株和重組菌株與鼠抗重組K88菌毛血清作用30m in后，再與IPEC-J2上皮細(xì)胞共同孵育2h，僅能檢測到2×103cfu。

3 討論

K88菌毛有K88ab、K88ac、K88ad 3種血清型，本實(shí)驗(yàn)首次擴(kuò)增編碼K88ab和K88ad的菌毛完整操縱子fae基因，將其克隆于pBR322中。將pBRK88ab和pBR-K88ad分別轉(zhuǎn)化入不表達(dá)任何菌毛的工程菌SE5000，使其在體外表達(dá)具有生物學(xué)活性的重組K88菌毛蛋白。

雖然不同血清型的K88菌毛在氨基酸組成上相差甚微，僅在菌毛主要結(jié)構(gòu)蛋白FeaG上有個(gè)別氨基酸有差別[9]，但只有K88ac是臨床上從病豬分離到的優(yōu)勢血清型[10]。Choi和Chae對臨床分離到的44株表達(dá)K88菌毛的ETEC進(jìn)行血清分型，42株為K88ac血清型，2株為K88ab血清型[11]。類似的，Alexa等進(jìn)行的K88血清分型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，34株K88陽性ETEC里K88ac占了29株，而K88ab和K88ad僅分別占了2株和3株[12]。本實(shí)驗(yàn)以IPEC-J2為細(xì)胞模型，比較了K88菌毛3種血清型的黏附性能，可部分解釋為什么K88ac為臨床優(yōu)勢血清型。黏附試驗(yàn)結(jié)果表明，表達(dá)K88ac血清型菌毛的野生菌和重組菌與IPEC-J2黏附的數(shù)目最多，表達(dá)K88ab血清型菌毛的細(xì)菌黏附數(shù)次之，而表達(dá)K88ad血清型菌毛的細(xì)菌與IPEC-J2黏附的最少(ac∶ab∶ad≈6∶3.5∶1)。結(jié)果顯示對小腸上皮細(xì)胞的黏附能力越強(qiáng)，該血清型越容易成為優(yōu)勢血清型。

但是，優(yōu)勢血清型的形成不僅僅取決于細(xì)菌的黏附素，動(dòng)物宿主的不同受體分布也對其有很大影響。按表達(dá)K88受體的種類為依據(jù)，現(xiàn)有研究已將豬分為6種表型[13-14]：表型A，表達(dá)3種血清型菌毛的細(xì)菌都黏附；表型B，黏附K88ab和K88ac；表型 C，黏附 K88ab和 K88ad；表型 D，只黏附K88ad；表型E，3種血清型都不黏附；表型F，只黏附K88ab。因此，當(dāng)?shù)刎i群為哪一種表型會(huì)很大程度地影響K88菌毛3種血清型哪種成為優(yōu)勢血清型。比如，如果當(dāng)?shù)刎i群均為D表型，那么K88ad必定成為該地的優(yōu)勢血清型。然而目前為止，尚無關(guān)于K88受體表型分布研究的報(bào)道。

病原菌ETEC K88通過其粘附素和宿主細(xì)胞表面相應(yīng)的大分子受體特異性結(jié)合感染易感仔豬，基于K88ab、K88ad粘附素fae基因的克隆、體外表達(dá)和IPEC-J2細(xì)胞體外感染模型，有望對病原菌ETEC K88黏附、侵入、增殖和宿主細(xì)胞應(yīng)答等多方面開展深入研究。

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