流式細(xì)胞儀在檢測(cè)系膜細(xì)胞衰老特征中的應(yīng)用

田 曉 史國(guó)輝 孫淑豐 孟曉華 馮曉明 徐湜潺 孫 原 董 科 王玉潯

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 唐山 063000)

流式細(xì)胞儀是采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)細(xì)胞或顆粒懸液進(jìn)行快速分析的自動(dòng)化分析儀器。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)通過(guò)對(duì)流動(dòng)液體中排成單列的細(xì)胞或顆粒進(jìn)行逐個(gè)分析、測(cè)定細(xì)胞或顆粒的光散射和熒光情況，以獲得其大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理及化學(xué)特征。這種分析儀器綜合了光學(xué)、電子學(xué)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)以及激光和計(jì)算機(jī)等多門(mén)學(xué)科和技術(shù)，具有檢測(cè)速度快、測(cè)量指標(biāo)多、采集數(shù)據(jù)量大、對(duì)所需的細(xì)胞或顆?？梢赃M(jìn)行分選等特點(diǎn)，在細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等方面得到了廣泛的應(yīng)用。本文正是根據(jù)FCM的特點(diǎn)，將其應(yīng)用到檢測(cè)系膜細(xì)胞衰老的特征中，驗(yàn)證其可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 3月齡健康雄性Wistar大鼠〔河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SCXK(京)2010-0013〕10只。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)粉劑及Trypsin(h1∶250)購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司。胎牛血清購(gòu)于美國(guó) Hyclone公司。5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)購(gòu)于美國(guó)Program公司。碘化吡啶(PI)及RNA酶購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠系膜細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取雙側(cè)腎臟，剝離腎包膜，用剪刀把腎皮質(zhì)剪成碎塊，放于重疊的3層不銹鋼篩網(wǎng)上研磨，鏡下觀(guān)察，若見(jiàn)98%以上的腎小球脫去包曼囊，視野中基本上無(wú)腎小管存在，即可停止沖洗，收集第2層篩網(wǎng)上的組織移入離心管，V型膠原酶消化后，應(yīng)用15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)原代的系膜細(xì)胞，約7 d后第1次傳代，傳代的細(xì)胞24 h全部貼壁，生長(zhǎng)迅速，形態(tài)為梭形或不規(guī)則星形，3～4 d已匯合成片，純度極高，經(jīng)鑒定結(jié)蛋白(Desmin)陽(yáng)性、抗Ⅷ因子抗體陰性，傳代，用于實(shí)驗(yàn)的為第3、5、10 代。

1.2.2 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)染色 種于六孔板中的各組細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合，用PBS液清洗3次，于室溫固定細(xì)胞5 min，PBS液清洗3次后，加上新配制的含1 mg/ml X-gal的 SA-β-gal染液，置 37℃(無(wú) CO2)溫育12～16 h，PBS液清洗3次后，觀(guān)察細(xì)胞胞質(zhì)中藍(lán)色沉淀，用數(shù)碼相機(jī)照相。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞自發(fā)熒光、細(xì)胞周期及細(xì)胞大小細(xì)胞培養(yǎng)至70% ～80%融合時(shí)，PBS洗2次，0.25%胰酶消化，收集離心管中。取1×106個(gè)細(xì)胞，75%乙醇4℃固定過(guò)夜(可于4℃存放1 w備用)。測(cè)定前離心除去75%乙醇，用PBS洗2次，重懸于0.5 ml PBS中。應(yīng)用Becton-Dickinson流式細(xì)胞儀(激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)570 nm)檢測(cè)自發(fā)熒光。然后樣品經(jīng)50 μg/ml RNA酶處理后，用PI 50 μg/ml于暗處染色30 min后上機(jī)。應(yīng)用流式細(xì)胞分析儀的FACScan測(cè)量DNA含量，以前向角散射光(FSC)的平均強(qiáng)度來(lái)反映細(xì)胞的大小，細(xì)胞周期變化數(shù)據(jù)用Cell FIT Cell Cycle Analysis Version 2.18.2軟件分析;以細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞百分率記錄數(shù)據(jù)并分析;細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS11.0軟件，計(jì)量資料使用±s表示，組間差異比較采用單因素方差。

2 結(jié)果

2.1 大鼠原代系膜細(xì)胞增殖能力 3月齡大鼠的原代系膜細(xì)胞為長(zhǎng)梭形或不規(guī)則星形，貼壁后生長(zhǎng)迅速，約3～4 d后可傳第1代，可傳10代以上。但在傳代過(guò)程中，系膜細(xì)胞逐漸衰老，細(xì)胞肥大，形態(tài)變扁平、伸展，排列稀疏，代謝減慢、生長(zhǎng)停滯，失去增殖和傳代能力。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為第3、5、10代。

2.2 細(xì)胞SA-β-gal染色結(jié)果 細(xì)胞衰老時(shí)均伴隨著β-半乳糖苷酶活性增高，因此SA-β-gal染色是目前國(guó)際公認(rèn)的細(xì)胞復(fù)制性衰老的特征性指標(biāo)〔1〕。本研究結(jié)果顯示:第3代系膜細(xì)胞染色陽(yáng)性率很低，僅為(8.6±2.5)%，而隨增齡，系膜細(xì)胞βgal染色陽(yáng)性率也逐漸增高，第5代為(27.0±3.9)%，而第10代細(xì)胞陽(yáng)性率高達(dá)(76.9±9.6)%，3組間兩兩相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)，表明大鼠原代系膜細(xì)胞隨傳代次數(shù)的增長(zhǎng)而發(fā)生衰老。

2.3 自發(fā)熒光的檢測(cè) 第3、5、10代自發(fā)熒光強(qiáng)度分別系膜細(xì)胞傳代過(guò)程中，自發(fā)熒光逐漸增強(qiáng)(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

2.4 不同代次系膜細(xì)胞的細(xì)胞大小 流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果顯示，第3代系膜細(xì)胞FSC熒光強(qiáng)度最弱，隨著傳代次數(shù)的增加，F(xiàn)SC熒光強(qiáng)度顯著增加，即細(xì)胞體積明顯增大。見(jiàn)圖2。

2.5 不同代次系膜細(xì)胞的周期分析 原代細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞增殖加速，處于S期的細(xì)胞明顯多于傳代中的各代細(xì)胞。系膜細(xì)胞在傳代過(guò)程中生長(zhǎng)逐漸減慢，細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的比例逐漸降低。傳代末期，細(xì)胞生長(zhǎng)趨于停滯，死亡細(xì)胞增加(表1)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各代細(xì)胞自發(fā)熒光

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FSC熒光強(qiáng)度

表1 不同代次系膜細(xì)胞的周期分析(%，n=3，±s)

表1 不同代次系膜細(xì)胞的周期分析(%，n=3，±s)

與第3代比較:1)P＜0.05;與第5代比較:2)P＜0.05

PI第3代 72.14±3.34 14.79±2.15 11.86±1.38 26.97±1.98組別 細(xì)胞周期G0/G1 S G2/M第5代 81.52±2.96 9.40±1.61 9.06±0.58 18.16±2.641)第10代 91.02±4.25 5.76±3.54 3.18±2.10 8.94±2.581)2)

3 討論

隨著年齡的增長(zhǎng)和細(xì)胞的老化，系膜細(xì)胞功能的下降與異常，與許多衰老相關(guān)腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展有著極為密切的關(guān)系〔2〕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)系膜細(xì)胞在傳代過(guò)程中，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生著明顯的變化。SA-β-gal是公認(rèn)的細(xì)胞老化的生物標(biāo)志。在各種類(lèi)型體內(nèi)或體外的老化細(xì)胞，該酶的活性增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在傳代過(guò)程中，細(xì)胞形態(tài)與功能發(fā)生著明顯的變化，細(xì)胞逐漸走向衰老。系膜細(xì)胞的自發(fā)熒光逐步增強(qiáng)。細(xì)胞傳代末期，細(xì)胞的自發(fā)熒光現(xiàn)象達(dá)到頂點(diǎn)。目前認(rèn)為，細(xì)胞自發(fā)熒光現(xiàn)象與細(xì)胞內(nèi)脂褐素的形成與積聚有關(guān)〔3〕。脂褐素的堆積促進(jìn)老年色素斑的出現(xiàn)，導(dǎo)致細(xì)胞分化能力降低，是細(xì)胞衰老的表現(xiàn)之一。研究人員發(fā)現(xiàn)脂褐素含量高的細(xì)胞在外界有害因素的作用下，較正常細(xì)胞更易出現(xiàn)損傷〔4〕。脂褐素與體內(nèi)氧自由基生成，導(dǎo)致溶酶體、線(xiàn)粒體等細(xì)胞器中的銅發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。過(guò)度加劇的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)量的脂褐素，從而出現(xiàn)脂褐素沉著。脂褐素沉積在細(xì)胞中，導(dǎo)致細(xì)胞代謝減緩、活性下降、細(xì)胞損傷等細(xì)胞老化的表現(xiàn)。在高傳代細(xì)胞，細(xì)胞的自發(fā)熒光產(chǎn)物顯著增加，自發(fā)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，說(shuō)明脂褐素的積累達(dá)頂峰?？梢?jiàn)，在衰老的過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)，并可能與氧自由基合成增加有關(guān)。

細(xì)胞肥大是衰老細(xì)胞的最基本標(biāo)志及形態(tài)特征〔5～8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著傳代次數(shù)的增加，F(xiàn)SC熒光強(qiáng)度顯著增加，即細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞逐漸衰老。

細(xì)胞周期狀態(tài)反映了細(xì)胞的增殖能力。增殖旺盛的細(xì)胞處于S期的比例較高〔9〕。細(xì)胞衰老時(shí)，細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。本結(jié)果說(shuō)明在不斷傳代時(shí)，由于細(xì)胞衰老，功能下降，DNA錯(cuò)配率增加，攝取各種物質(zhì)的能力降低，隨之而來(lái)的是增殖減緩。

綜上所述，隨著系膜細(xì)胞不斷的傳代，細(xì)胞形態(tài)退化，SA-β-gal活性增強(qiáng)，體積增大，細(xì)胞增殖能力降低，顯示細(xì)胞有明顯的復(fù)制性衰老特征〔10～12〕。在系膜細(xì)胞衰老的過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)，導(dǎo)致自發(fā)熒光產(chǎn)物增加。而流式細(xì)胞儀能很好的檢測(cè)到這些改變，因此它是一種檢測(cè)細(xì)胞衰老指標(biāo)的良好方法，可以廣泛應(yīng)用到細(xì)胞衰老的研究中。

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