唐士超 周達岸

結(jié)腸癌是一種常見的腫瘤疾病，嚴重威脅著人類的健康，但其發(fā)病機制不清，目前仍無有效治療手段。微量元素硒與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，結(jié)腸癌患者體內(nèi)常缺乏含硒化合物［1］，硒缺乏可能是結(jié)腸癌發(fā)生的重要機制之一。長春新堿在結(jié)腸癌的治療過程中發(fā)揮了重要作用，但副作用較為明顯，在一定程度上限制了其臨床應用，積極探索長春新堿的配伍用藥，減少其用量具有重要臨床意義。因此，本文擬探討亞硒酸鈉與長春新堿聯(lián)合用藥對結(jié)腸癌細胞HT-29的影響及機制，以期為結(jié)腸癌的臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 HT-29結(jié)腸癌細胞株(中科院上海細胞庫)，DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco公司)，噻唑藍(MTT，南京建成生物工程研究所)，Cyclin D1蛋白抗體(Santa公司)，酶標儀(北京普郎克公司)。

1.2 實驗分組 以1×104/孔的密度將HT-29細胞接種于96孔板內(nèi)分組培養(yǎng)，對照組不添加處理因素(MDEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清)，亞硒酸鈉組含10 μmol/L亞硒酸鈉，長春新堿組含40 μg/L長春新堿，聯(lián)合給藥組含10 μmol/L亞硒酸鈉及40 μg/L長春新堿。

1.3 MTT法檢測 HT-29細胞存活率 分組培養(yǎng)24、48、72 h后，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，96孔板每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，4 h后棄去培養(yǎng)液加入150 μl二甲亞砜并振蕩15 min，酶標儀490 nm波長檢測各孔吸光度(A值)，細胞活力=檢測組A值/對照組A值×100%。

1.4 Western-blot檢測 Cyclin D1蛋白表達 根據(jù)MTT實驗結(jié)果，檢測細胞活力降低明顯時HT-29細胞Cyclin D1蛋白表達。粉碎細胞后4℃ 12000 r/min離心15 min，測定并調(diào)節(jié)上清蛋白濃度，SDS-PAGE電泳蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以Cyclin D1蛋白及β-actin一抗室溫下分別孵育2 h，再以辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，利用ECL發(fā)光試劑盒顯影。以β-actin為內(nèi)對照，觀察Cyclin D1蛋白表達變化。

2 結(jié)果

2.1 亞硒酸鈉及長春新堿對HT-29細胞活力的影響 MTT實驗顯示，亞硒酸鈉及長春新堿均可抑制HT-29細胞活力，聯(lián)合用藥效果更為顯著。分組72 h后HT-29結(jié)腸癌存活率降低最為顯著，因此本研究檢測了分組72 h后Cyclin D1蛋白表達變化(表1)。

表1 亞硒酸鈉及長春新堿對HT-29細胞活力的影響(n=6/組)

2.2 亞硒酸鈉及長春新堿對HT-29細胞Cyclin D1蛋白表達的影響 Western blot檢測顯示，亞硒酸鈉及長春新堿均可下調(diào)HT-29細胞Cyclin D1蛋白表達，且聯(lián)合用藥Cyclin D1蛋白表達降低更為明顯(圖1)。

圖1 Cyclin D1蛋白表達變化

3 討論

結(jié)腸癌是一種臨床常見病多發(fā)病，在40～50歲年齡組發(fā)病率為高，結(jié)腸癌患者體內(nèi)硒元素含量常明顯降低［1］，補充硒可以有效降低大鼠及小鼠的皮膚癌、乳腺癌、肝癌及結(jié)腸癌的發(fā)生率［2］，但其機制尚不完全清楚。Cyclin D1是一種細胞周期蛋白，與細胞增殖分化關(guān)系密切，可促進細胞生長分裂Cyclin D1蛋白表達上調(diào)是癌細胞永生化的重要機制之一。研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織中Cyclin D1蛋白表達明顯上調(diào)［3］，且直結(jié)腸癌細胞HCT116和SW480中Cyclin D1也有表示上調(diào)表現(xiàn)［4］。本研究顯示，HT-29人結(jié)腸癌細胞中Cyclin D1蛋白大量表達，給予亞硒酸鈉可明顯抑制HT-29結(jié)腸癌細胞Cylin D1表達，并抑制HT-29細胞活力。研究結(jié)果提示Cylin D1表達上調(diào)是HT-29細胞增殖分化的重要機制之一，下調(diào)Cylin D1表達可能是亞硒酸鈉降低HT-29細胞活力的重要機制之一。

長春新堿是一種從長春花中提取的生物堿，抗腫瘤作用已獲得廣泛認可，但其毒副作用較強，對神經(jīng)系統(tǒng)的毒副作用尤為明顯，且長期使用易產(chǎn)生耐藥性，因而限制了其臨床應用。本研究表明，長春新堿可明顯抑制HT-29結(jié)腸癌細胞活力，下調(diào)Cyclin D1蛋白表達。結(jié)果提示長春新堿可通過下調(diào)Cyclin D1抑制HT-29細胞活力。長春新堿與亞硒酸鈉聯(lián)合給藥對HT-29結(jié)腸癌細胞Cyclin D1表達抑制作用更為明顯，對細胞活力抑制也更為顯著，提示二者聯(lián)合給藥可提高抗腫瘤作用，為結(jié)腸癌的臨床治療提供了理論依據(jù)。

［1］郁寶銘，王敏，許叔祥，等.大腸癌患者硒與免疫功能關(guān)系的研究.上海第二醫(yī)科大學學報，1996，34(1):50-53.

［2］杜明，王聰，張?zhí)m威，等.硒的生物學功能及其補充劑的研究現(xiàn)狀.生物信息學，2007，5(4):176-178.

［3］金錦蓮，張端蓮，談新提.應用組織芯片檢測大腸癌組織中p27和cyclin D1的表達及意義.中國組織化學與細胞化學雜志，2012，21(2):113-117.

［4］羅慧，楊洋，許彩民.亞硒酸鈉對結(jié)直腸癌HCT116和SW480細胞中β-catenin及下游靶基因cyclin D1表達的影響.中國醫(yī)學科學院學報，2011，33(6):654-658.