席廣民，李 龍，姜 晨，傅一鳴，楊曉蕾，于 雷

(1 齊魯師范學(xué)院，濟(jì)南 250000;2 泰安市腫瘤防治院;3 濟(jì)南市婦幼保健院;4 山東萬杰醫(yī)院)

人腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見腫瘤，膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為顯示高度惡性，在腦內(nèi)多呈浸潤性生長(zhǎng)，與正常腦組織無明確的邊界，因而單純的手術(shù)切除往往不能阻斷腫瘤的進(jìn)展和復(fù)發(fā)，5年存活率為20%～30%［1，2］。放射治療是對(duì)腦膠質(zhì)瘤有效的輔助治療，但腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)常規(guī)的放療有很強(qiáng)的抵抗能力。因此，對(duì)膠質(zhì)瘤輻射抗性的研究意義重大。在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程中，經(jīng)常會(huì)伴有磷酯酰肌醇3 激酶(PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號(hào)通路的異常改變。PI3K 信號(hào)通路可介導(dǎo)多種胞外刺激，而Akt 是其關(guān)鍵的下游信號(hào)傳導(dǎo)分子，Akt 活化后可啟動(dòng)一系列生物反應(yīng)，包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移以及血管的生成等［3］。因此，該信號(hào)通路成為人們感興趣的分子治療靶標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究了PI3K 信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)分子Akt在腦膠質(zhì)瘤中的活化情況，并探討了PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活與腦膠質(zhì)瘤放射敏感性之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2006年4月～2009年12月山東萬杰醫(yī)院手術(shù)切除的腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤石蠟標(biāo)本40 份。40例患者中，男23例、女17例，年齡45～75歲、平均53.2歲。根據(jù)WHO 2000年關(guān)于神經(jīng)上皮源性腫瘤惡性程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為:Ⅰ級(jí)11例、Ⅱ級(jí)13例、Ⅲ級(jí)11例、Ⅳ級(jí)5例。同期選擇正常腦組織標(biāo)本6 份作為對(duì)照，男4例、女2例，年齡48～66歲、平均55歲。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 檢測(cè)Akt 基因的相對(duì)表達(dá)量 取新鮮的腫瘤組織，離體后凍于液氮中，轉(zhuǎn)入－80 ℃保存，用于提取RNA。按照Trizol 試劑說明書操作步驟提取組織總RNA。以總RNA 為模板，加入隨機(jī)引物和MMLV，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。將逆轉(zhuǎn)后的cDNA 稀釋4 倍后作為模板，用SYBR Premix Ex Taq 在ABI PRISM 7700機(jī)器上進(jìn)行定量PCR。未加cDNA 管作陰性對(duì)照。反應(yīng)條件如下:95 ℃10 s，95 ℃5 s，59 ℃12 s，72 ℃20 s，40個(gè)循環(huán)。用GAPDH 作為內(nèi)參，2-ΔΔCT作為比較基因表達(dá)變化的方法?；虻谋磉_(dá)水平變化2 倍及以上作為基因表達(dá)增高或降低的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 免疫組化檢測(cè)pAkt 蛋白的表達(dá) 選擇腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤、正常腦組織石蠟標(biāo)本，常規(guī)固定、石蠟包埋后切成4 μm 切片。組織切片脫蠟至水;3% H2O210 min 消除內(nèi)源性過氧化物酶，微波爐抗原熱修復(fù)15 min;PBS 洗5 min×3 次;使用10%正常山羊血清，37℃孵育15 min 進(jìn)行封閉，甩干血清;滴加抗pAKT 抗體(Santa Cruz)，稀釋度為1∶50，4 ℃過夜。PBS 洗5 min×3 次;滴加二抗室溫孵育50 min，PBS 洗5 min×3 次;然后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的三抗，37 ℃孵育15 min，PBS 洗5 min×3 次;3，3-二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片。以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3 LY294002 對(duì)X 線作用后的U87 細(xì)胞增殖的影響 取單層貼壁生長(zhǎng)的U87 細(xì)胞，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度為95%的孵箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96 孔培養(yǎng)板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)16～24 h，空白對(duì)照組加2.5 μmol/L的DMSO，對(duì)照組在空白對(duì)照組基礎(chǔ)上+5 Gy X 線照射。實(shí)驗(yàn)組1、2、3 分別加入2.5、5、10 μmol/L的LY294002，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后進(jìn)行5 Gy的X 線照射，照射后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。終止培養(yǎng)前4 h，加MTT 工作液(0.5 mg/mL)10 μL，4 h 后吸棄上清，加入DMSO，振蕩后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s 表示，比較采用t 檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Akt mRNA 在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá) 在mRNA水平，與正常腦組織相比，Akt 基因在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)增高5.8 倍(P＜0.01)。

2.2 pAkt 蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá) 免疫組化顯示腦膠質(zhì)瘤中pAkt 蛋白在胞核和胞質(zhì)中均有表達(dá)。pAkt 在72.5%的腦膠質(zhì)瘤組織中陽性表達(dá)。正常組織中僅14.3%的表達(dá)。見圖1。

圖1 pAkt 蛋白在正常腦組織及腦腦質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

2.3 pAkt 蛋白的表達(dá)與臨床病理分級(jí)之間的關(guān)系見表1。

表1 pAkt的表達(dá)與臨床病理分級(jí)的關(guān)系(例)

2.4 LY294002 對(duì)輻射誘導(dǎo)的U87 細(xì)胞增殖抑制作用 LY294002 能明顯提高輻射對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的增殖抑制作用，2.5、5、10 μmol/L的LY294002 分別使5 Gy X 線照射的細(xì)胞存活率從76.0% 降至61.0%、49.0%、37.6%。見圖2。

圖2 LY294002 對(duì)輻射誘導(dǎo)的U87 細(xì)胞增殖抑制作用

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與的多步驟演變過程，如表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因擴(kuò)增和過表達(dá)就是惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生的一個(gè)早期事件［4］。EGFR的過表達(dá)可以通過激活PI3K/Akt 信號(hào)通路而引起細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［5］。Chiariello 等［6］研究顯示，59%的原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本中存在PTEN 位點(diǎn)的雜合性缺失，PTEN 突變或缺失后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)PI3K 通路的激活，從而活化其下游的蛋白激酶Akt。Akt 被PI3K 磷酸化激活以后，在腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲性生長(zhǎng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)無論在mRNA 水平，還是在蛋白水平，Akt在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)都明顯高于正常腦組織，表明Akt在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。

腦膠質(zhì)瘤的術(shù)后治療是延長(zhǎng)患者生存期的關(guān)鍵，放射治療是腦膠質(zhì)瘤的有效輔助治療手段，如何提高腫瘤組織的放射敏感性，增強(qiáng)正常組織的放射抗性是當(dāng)前腫瘤放射生物學(xué)及臨床放療研究的熱點(diǎn)。已有研究表明PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活與腫瘤細(xì)胞的放射敏感性相關(guān)。Tomita 等［7］發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt 信號(hào)通路阻斷劑Wortmannin 阻斷該信號(hào)通路后，可以明顯提高體外培養(yǎng)的中國倉鼠細(xì)胞V79 對(duì)X 線的敏感性，Cataldi 等［8］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用15 Gy 電離照射Friend 紅白血病細(xì)胞時(shí)，PI3K/Akt 信號(hào)通路可以被激活，當(dāng)用Wortmannin 或LY294002 抑制該通路后，細(xì)胞對(duì)輻射敏感性明顯增高。在本研究中，我們采用PI3K的特異性抑制劑LY294002 抑制PI3K 信號(hào)通路，它可以通透細(xì)胞，特異性抑制PI3K的激酶活性，抑制Akt的磷酸化［9］，分別用2.5、5、10 μmol/L的LY294002 阻斷PI3K/Akt 信號(hào)通路以后，發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87 對(duì)X 線照射的敏感性明顯增加，顯示PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活參與了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放射的耐受性。

PI3K/Akt 信號(hào)通路可以通過多種機(jī)制來提高腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放射的耐受性。電離輻射所引起的DNA 雙鏈斷裂是一種嚴(yán)重的致死性DNA 損傷，其修復(fù)除了依賴重組修復(fù)之外，另外一種重要的修復(fù)機(jī)制是非同源末端連接，DNA-PKcs 是該修復(fù)過程中的重要蛋白［10］，PI3K/Akt 信號(hào)通路可以通過提高DNAPKcs的表達(dá)，來提高腫瘤細(xì)胞的損傷修復(fù)能力［11］。另外，PI3K/Akt 通路活化后，也可以通過DNA 修復(fù)相關(guān)酶——DNA 聚合酶β的活性，提高腫瘤細(xì)胞的DNA 損傷修復(fù)能力［8］。此外，Zhong 等［12］的研究顯示，腫瘤被輻射后，殘余的腫瘤細(xì)胞通常處于乏氧環(huán)境，低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)在提高腫瘤細(xì)胞對(duì)乏氧環(huán)境的適應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，HIF-1 所調(diào)控的基因表達(dá)需要依賴PI3K/Akt 信號(hào)通路的活化。PI3K/Akt活化后也可以抑制輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，pAkt 可以通過磷酸化Bad 和Caspase9 而抑制細(xì)胞凋亡［13］。Diehl 等［14］發(fā)現(xiàn)，Akt 活化后也可以提高cyclinD1的穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S 期轉(zhuǎn)變，促進(jìn)細(xì)胞增殖。Edwards 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 信號(hào)通路阻斷后可以提高腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性，增強(qiáng)輻射對(duì)腫瘤血管的破壞，當(dāng)把LY294002 和輻射聯(lián)用時(shí)，可以明顯延長(zhǎng)腫瘤復(fù)發(fā)的時(shí)間。

綜上所述，PI3K/Akt 信號(hào)通路與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的輻射敏感性密切相關(guān)，該通路可以通過多種機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性，該通路的一些信號(hào)阻斷劑可能會(huì)為放射治療腦膠質(zhì)瘤提供新型的放射增敏藥物。

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