劉巍 曹穎 沈軍等

[摘要] 目的 設(shè)計(jì)一種牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1（DMP-1）的仿生多肽，仿生DMP-1與膠原纖維結(jié)合，并啟動礦化功能。

方法 依據(jù)DMP-1與膠原纖維結(jié)合的功能序列以及釉原蛋白介導(dǎo)羥磷灰石成核的功能序列，采用固相合成法合成DMP-1仿生多肽，其氨基酸序列為DSESSEEDRTKREEVD。利用免疫熒光法評價該多肽與膠原蛋白的結(jié)合能力；將其依次浸入氯化鈣溶液和磷酸氫二鈉溶液中，采用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）以及選區(qū)電子衍射環(huán)（SAD）分析其誘導(dǎo)羥磷灰石晶體成核生長的礦化能力。結(jié)果 免疫熒光結(jié)果表明：本研究設(shè)計(jì)的DMP-1仿生多肽可以與牙本質(zhì)膠原纖維結(jié)合；SEM、TEM觀察結(jié)果顯示：該多肽可以從溶液中攝取鈣磷離子，誘導(dǎo)羥磷灰石晶體成核礦化。結(jié)論 多肽DSESSEEDRTKREEVD可以模擬DMP-1與膠原蛋白結(jié)合及啟動礦化的能力，可以作為研究牙本質(zhì)仿生礦化的一種分子工具。

[關(guān)鍵詞] 牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1； 多肽； 仿生； 生物礦化

[中圖分類號] R 739.86 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.003

從微結(jié)構(gòu)構(gòu)成角度看，牙本質(zhì)是由礦化的膠原纖維組成的多等級結(jié)構(gòu)[1]。如何誘導(dǎo)牙本質(zhì)病變區(qū)

脫礦的膠原纖維內(nèi)礦化（intrafibrillar apatite），復(fù)制礦化膠原纖維的多等級結(jié)構(gòu)，恢復(fù)牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)的機(jī)械學(xué)性能，是目前的研究熱點(diǎn)之一[2]，也是牙本質(zhì)仿

生礦化的主要研究內(nèi)容。生物礦化是有機(jī)基質(zhì)模板調(diào)控下的無機(jī)晶體的成核生長與有機(jī)基質(zhì)共組裝的過程[1，3]。膠原蛋白是牙本質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)蛋白，但是體外實(shí)驗(yàn)[2]表明，僅用單純的牙本質(zhì)膠原蛋白來啟

動礦化成核，特別是實(shí)現(xiàn)膠原纖維內(nèi)礦化是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，還需其他生物分子的參與。研究[2，4]發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型膠原與牙本質(zhì)非膠原蛋白的相互作用是牙本質(zhì)礦物晶體形成的必要條件。牙本質(zhì)非膠原蛋白主要包括牙本質(zhì)涎磷蛋白、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1（dentin matrix protein-1，DMP-1）、骨涎蛋白、磷蛋白、骨橋蛋白等，它們富含天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸以及磷酸化的絲氨酸殘基，其中-COOH、-PO4可以作為成核位點(diǎn)啟動礦化。

DMP-1結(jié)合于牙本質(zhì)膠原纖維的孔隙區(qū)域，可以促使晶體礦化顆粒沿膠原纖維長軸方向生長，在啟動膠原纖維的礦化中起重要作用[5-9]。應(yīng)用DMP-1

調(diào)控膠原纖維礦化是一種理想的途徑，但是DMP-1提取困難且價格昂貴，易變性，因此尋求DMP-1的小分子仿生體具有重要的價值。自組裝多肽的研制成功[10-13]，為牙本質(zhì)仿生礦化提供了新的思路。在蛋白質(zhì)分子層面，DMP-1的349DSESSEEDR357和424-SEENRDSDSQDSSR437是與膠原纖維結(jié)合的特定功能域結(jié)構(gòu)[6]；而376ESNES380、386ESQES390、414-QESQSEQDS422、431DSQDS435是其誘導(dǎo)磷灰石成核礦化的功能域[8]。釉原蛋白是釉質(zhì)發(fā)育中最重要的

蛋白質(zhì)，其自組裝的納米微球超分子結(jié)構(gòu)是調(diào)控磷灰石晶體組裝成釉柱結(jié)構(gòu)的分子基礎(chǔ)。釉原蛋白分子C-端親水的帶電荷氨基酸尾巴“TKREEVD”位于釉原蛋白超分子結(jié)構(gòu)的表面，與羥磷灰石（hydroxy-lapatite，HA）的成核礦化密切相關(guān)[14]。考慮到DMP-1與膠原纖維結(jié)合的序列424SEENRDSDSQDSSR437與誘導(dǎo)礦化成核的序列414QESQSEQDS422存在重疊現(xiàn)象，本研究擬以DMP-1與膠原蛋白結(jié)合的氨基酸序列349DSESSEEDR357以及釉原蛋白與HA成核有關(guān)的C-端親水氨基酸序列TKREEVD為基礎(chǔ)，構(gòu)建一種新型的多肽分子，即DSESSEEDRTKREEVD，作為DMP-1的仿生體，評價其與膠原纖維的結(jié)合能力和誘導(dǎo)HA晶體成核的作用，為牙本質(zhì)以及牙體組織的仿生礦化研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 DMP-1仿生多肽的設(shè)計(jì)與合成

采用固相合成法，通過肽鍵連接DSESSEEDR和TKREEVD兩個寡肽片段，合成DMP-1仿生多肽的氨基酸序列，即DSESSEEDRTKREEVD；與此同時，采用相同的方法合成異硫氰酸熒光素（fluorescein iso-

thiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的相同序列多肽，即FITC-

DSESSEEDRTKREEVD，用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)。

本研究所用多肽委托上?？齐纳镉邢薰竞铣?，產(chǎn)品經(jīng)高效液相色譜儀純化以及質(zhì)譜儀檢驗(yàn)符合要求，其純度為98%。

1.2 DMP-1仿生多肽與膠原纖維的結(jié)合能力

1.2.1 脫礦牙本質(zhì)膠原纖維網(wǎng)片的制備 制備厚約0.5 mm的健康離體牙的牙本質(zhì)片4片，置入500 mL 1%HCl溶液中，室溫下磁力攪拌48 h以脫礦，然后漂洗，獲得完全脫礦的牙本質(zhì)膠原纖維網(wǎng)薄片。

1.2.2 脫礦效果評價 取2個脫礦牙本質(zhì)膠原纖維網(wǎng)片行梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥儀（Quorum-Emitech K850型，Quorum公司，英國）行臨界點(diǎn)干燥，掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）（S-4800

型，Hitachi Limited公司，日本）下觀察表面形貌，通過X射線衍射儀（X-ray diffractometer，XRD）（XPert

PRO型，Philips公司，美國）確定晶體結(jié)構(gòu)，評價是否完全脫礦。

1.2.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)測定多肽與膠原纖維的結(jié)合能力 將另外2個完全脫礦的牙本質(zhì)膠原纖維網(wǎng)片做常規(guī)冰凍切片，制作約10 μm厚的脫礦牙本質(zhì)切片，取4片切片浸入含1%（體積分?jǐn)?shù)）的牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）水溶液中孵育30 min（37 ℃），以阻擋非特異性吸附，然后吸出BSA溶液，將50 μL 0.5 g·L-1 FITC標(biāo)記的多肽溶液（n=2，實(shí)驗(yàn)組）以及0.1 g·L-1的FITC標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體（武漢市博斯特生物技術(shù)有限公司）（n=2，陰性對照組）分別滴加在牙本質(zhì)片表面；樣品在37 ℃環(huán)境下孵育30 min后，用PBS溶液漂洗（重復(fù)3次，每次5 min），然后置于熒光顯微鏡（DMI3000B Leica Microsystems型，CMS GmbH公司，德國）下，觀察多肽與牙本質(zhì)膠原纖維的結(jié)合情況。

1.3 DMP-1仿生多肽誘導(dǎo)HA晶體成核的能力

在透射電子顯微鏡（transmission electron micro-scopy，TEM）載物用鍍膜銅網(wǎng)上滴加5 g·L-1的多肽溶

液40 μL后，再滴加2.5%戊二醛約10 μL以固定多肽，將滴加了多肽的銅網(wǎng)分別在10 mmol·L-1氯化鈣溶液和5 mmol·L-1磷酸氫二鈉溶液中各浸泡1 h（37 ℃），作

為1個循環(huán)，共進(jìn)行5個循環(huán)完成交替礦化實(shí)驗(yàn)，以沒有多肽涂層的銅網(wǎng)作為陰性對照；交替礦化后用蒸餾水漂洗，待銅網(wǎng)自然干燥，用SEM（FE-SEM，

Sirion 200型，F(xiàn)EI公司，美國）和TEM（TEMH-300型，Hitachi Limited公司，日本）觀察沉積物的形態(tài)，以選區(qū)電子衍射環(huán)（selected area diffraction，SAD）確定晶體結(jié)構(gòu)，分析DMP-1仿生多肽從溶液中攝取鈣和磷酸根離子，及誘導(dǎo)HA晶體成核生長的能力。

2 結(jié)果

2.1 DMP-1仿生多肽與牙本質(zhì)膠原纖維網(wǎng)的特異性

結(jié)合能力測定

SEM觀察顯示：牙本質(zhì)片經(jīng)HCl溶液處理后完全脫礦成為膠原纖維網(wǎng)（圖1），未見HA晶體存在。經(jīng)

XRD檢查可進(jìn)一步確定，脫礦的牙本質(zhì)基質(zhì)中無HA峰存在，僅在20°左右有膠原纖維寬峰（圖2）。由此

可見，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法可實(shí)現(xiàn)牙本質(zhì)完全脫礦。

A：× 2 000；B：× 80 000。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，采用熒光蛋白標(biāo)記的多肽分子，以熒光標(biāo)記的免疫球蛋白抗體作為陰性對照，結(jié)果顯示：DMP-1仿生多肽可以與牙本質(zhì)膠原纖維結(jié)合，熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光，呈陽性結(jié)果（圖3A）；而對照組視野中鮮有免疫熒光，呈陰性

結(jié)果（圖3B）。

2.2 DMP-1仿生多肽誘導(dǎo)HA晶體成核生長能力的

測定分析

本研究將DMP-1仿生多肽組裝在TEM的銅網(wǎng)上，交替浸入氯化鈣溶液和磷酸氫二鈉溶液進(jìn)行礦化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，這樣可以直接觀測到礦化結(jié)果。經(jīng)過交替礦化處理后，通過TEM觀察到有晶體形態(tài)的物質(zhì)沉積在銅網(wǎng)上，排列有序并向一定方向延伸（圖

4A），與對照組（圖4B）有明顯差別。觀察TEM表征的同時對DMP-1仿生多肽組深色晶體區(qū)域提取電子衍射圖，得到晶體電子衍射環(huán)圖（圖4A中的插圖a），符合HA晶體的結(jié)構(gòu)。通過SEM觀察進(jìn)一步證實(shí)，銅網(wǎng)表面均勻分布有片狀晶體，多聚集成束（圖5A）；

而沒有多肽涂層的銅網(wǎng)，則觀察不到晶體樣結(jié)構(gòu)（圖4B、圖5B）。

A：DMP-1仿生多肽與牙本質(zhì)膠原纖維結(jié)合，可見綠色熒光；B：對照組抗免疫球蛋白抗體不能與膠原纖維結(jié)合，罕見綠色熒光。

A：DMP-1仿生多肽誘導(dǎo)HA晶體形成；a：晶體電子衍射環(huán)，圖中數(shù)字表示特征環(huán)，符合HA晶體的特征；B：對照組無晶體形成。

A：DMP-1仿生多肽誘導(dǎo)HA晶體形成；B：對照組無晶體形成。

3 討論

為了克服生物大分子，特別是蛋白質(zhì)分子來源困難、存在變性特性等方面的不足，分子仿生學(xué)的重要目的之一就是設(shè)計(jì)小分子物質(zhì)來替代生物大分子，復(fù)制生物大分子的功能。受生物系統(tǒng)自組裝行為的啟發(fā)，以及“bottom-up”納米技術(shù)的發(fā)展，自組裝短肽類生物材料作為一類新的生物材料越來越受到人們的關(guān)注[15]。許多自組裝多肽，包括β-折疊離子多肽、肽兩親物已被用于細(xì)胞培養(yǎng)、組織再生，以及作為藥物和基因的載體等方面。近年來自組裝聚陰離子多肽也被用于仿生礦化的研究。Hartgerink等[10]開發(fā)出一種多肽兩親物，具有烷基尾巴，并含有一個離子多肽[C16H31OCCCCGGGS（PO4）RGD]，可以自組裝形成納米纖維，形成類似礦化膠原纖維樣的結(jié)構(gòu)。Kirkham等[11]開發(fā)了一種β-折疊自組裝聚陰離子多肽（QQRFEWEFEQQ），用于釉質(zhì)的再礦化和骨組織工程支架的構(gòu)建。有學(xué)者[12-13]依據(jù)DMP-1、骨涎

蛋白與膠原結(jié)合的功能域以及與磷灰石結(jié)合的功能域，設(shè)計(jì)了一種非膠原蛋白模擬多肽——E8DS聚陰離子多肽（EEEEEEEEDSpESpSpEEDR），可以與Ⅰ型膠原結(jié)合并促進(jìn)其仿生礦化。

多肽作為一類新型的生物材料在模擬生物大分子的功能方面已經(jīng)顯示出良好的應(yīng)用前景。誘導(dǎo)脫礦的牙本質(zhì)膠原纖維網(wǎng)再礦化是目前牙本質(zhì)再礦化研究的熱點(diǎn)之一。非膠原蛋白與膠原纖維的結(jié)合是啟動膠原纖維礦化的分子基礎(chǔ)。由于天然的非膠原蛋白含量較少，來源有限且價格昂貴，因此本研究設(shè)計(jì)了一種多肽類小分子來仿生非膠原蛋白與膠原纖維結(jié)合啟動礦化，以期應(yīng)用于膠原纖維的仿生礦化研究。作為啟動膠原纖維礦化的非膠原蛋白的仿生體，必須滿足兩個先決條件：1）可以與膠原纖維結(jié)合，2）可以攝取鈣磷離子誘導(dǎo)HA晶體的形成。本研究在設(shè)計(jì)多肽分子氨基酸序列時充分考慮了牙體組織礦化的特點(diǎn)，選取了DMP-1與膠原纖維結(jié)合的氨基酸序列DSESSEEDR及與HA成核有關(guān)的釉原蛋白分子C-端親水的帶電荷氨基酸尾巴TKREEVD，構(gòu)建DMP-1仿生多肽。通過觀察熒光標(biāo)記的多肽分子，直接證明了多肽分子與脫礦的牙本質(zhì)膠原纖維的結(jié)合能力；通過將載有多肽分子的TEM載物用銅網(wǎng)交替浸入含鈣和磷酸根離子溶液中來觀察多肽的誘導(dǎo)礦化作用，證明了DMP-1仿生多肽可從溶液中攝取鈣、磷酸根離子誘導(dǎo)HA晶體形成。由此可見，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的多肽DSESSEEDRTKREEVD滿足了作為非膠原蛋白DMP-1仿生體的先決條件，具有與膠原蛋白結(jié)合和啟動礦化的能力，可以作為研究牙本質(zhì)仿生礦化的分子工具；下一步將應(yīng)用此多肽分子誘導(dǎo)脫礦的牙本質(zhì)膠原纖維再礦化，修復(fù)病變牙本質(zhì)的結(jié)構(gòu)，恢復(fù)其機(jī)械性能。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Luz GM， Mano JF. Mineralized structures in nature： Examples and

inspirations for the design of new composite materials and bioma-

terials[J]. Compos Scie and Technol， 2010， 70（13）：1777-1788.

[2] Gu LS， Huffman BP， Arola DD， et al. Changes in stiffness of resin-

infiltrated demineralized dentin after remineralization by a bottom-

up biomimetic approach[J]. Acta Biomater， 2010， 6（4）：1453-1461.

[3] George A， Ravindran S. Protein templates in hard tissue enginee-

ring[J]. Nano Today， 2010， 5（4）：254-266.

[4] George A， Veis A. Phosphorylated proteins and control over apatite

nucleation， crystal growth， and inhibition[J]. Chem Rev， 2008， 108

（11）：4670-4693.

[5] George A， Sabsay B， Simonian PA， et al. Characterization of a no-

vel dentin matrix acidic phosphoprotein. Implications for induction

of biomineralization[J]. J Biol Chem， 1993， 268（17）：12624-12630.

[6] He G， George A. Dentin matrix protein 1 immobilized on type Ⅰ

collagen fibrils facilitates apatite deposition in vitro[J]. J Biol Chem，

2004， 279（12）：11649-11656.

[7] Tartaix PH， Doulaverakis M， George A， et al. In vitro effects of

dentin matrix protein-1 on hydroxyapatite formation provide insights

into in vivo functions[J]. J Biol Chem， 2004， 279（18）：18115-18120.

[8] He G， Dahl T， Veis A， et al. Nucleation of apatite crystals in vitro

by self-assembled dentin matrix protein 1[J]. Nat Mater， 2003， 2

（8）：552-558.

[9] He G， Dahl T， Veis A， et al. Dentin matrix protein 1 initiates

hydroxyapatite formation in vitro[J]. Connect Tissue Res， 2003， 44

（Suppl 1）：240-245.

[10] Hartgerink JD， Beniash E， Stupp SI. Self-assembly and mineraliza-

tion of peptide-amphiphile nanofibers[J]. Science， 2001， 294（5547）：

1684-1688.

[11] Kirkham J， Firth A， Vernals D， et al. Self-assembling peptide scaf-

folds promote enamel remineralization[J]. J Dent Res， 2007， 86（5）：

426-430.

[12] Wang Q， Wang XM， Tian LL， et al. In situ remineralizaiton of

partially demineralized human dentine mediated by a biomimetic

non-collagen peptide[J]. Soft Matter， 2011， 7（20）：9673-9680.

[13] 王秀梅， 王瓊， 程振江， 等. 非膠原蛋白模擬多肽E8DS促進(jìn)Ⅰ型

膠原仿生礦化[J]. 材料研究學(xué)報， 2011， 25（3）：225-230.

Wang Xiumei， Wang Qiong， Cheng Zhenjiang， et al. Biominerali-

zation of type Ⅰ collagen promoted by an engineered non-collagen

protein-derived peptide E8DS[J]. Chin J Mater Res， 2011， 25（3）：

225-230.

[14] Du C， Falini G， Fermani S， et al. Supramolecular assembly of ame-

logenin nanospheres into birefringent microribbons[J]. Science， 2005，

307（5714）：1450-1454.

[15] Chow D， Nunalee ML， Lim DW， et al. Peptide-based biopolymers

in biomedicine and biotechnology[J]. Mater Sci Eng R Rep， 2008，

62（4）：125-155.

（本文采編 王晴）