姜安娜 曹名鋒 李慶剛 鄭平 楊洪江 孫際賓

賴氨酸是世界上僅次于谷氨酸的第二大氨基酸品種，目前主要應(yīng)用于飼料添加劑［1-3］、食品添加劑和醫(yī)藥中間體［4-8］。隨著科技的發(fā)展，賴氨酸品種已經(jīng)發(fā)展出賴氨酸鹽酸鹽、蛋白賴氨酸和液體賴氨酸等［9，10］。截止到2010年底，世界市場每年的賴氨酸需求量達(dá)140萬噸，按照工業(yè)賴氨酸計(jì)算，其直接市值達(dá)200億元，間接市場難以估量［11］。

目前常用的賴氨酸檢測(cè)方法主要有酶法、高效液相色譜（HPLC）和化學(xué)法（茚三酮）法。酶法主要是通過賴氨酸在特異的氧化酶催化下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，其電子產(chǎn)物在生物傳感器電極表面形成電流從而進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)準(zhǔn)確度和應(yīng)用性受酶活力和酶價(jià)格的限制；HPLC方法采用2，4-二硝基氟苯（DNFB）、1-氟-2，4-二硝基苯基 -5-L-丙氨酰胺（FDAA）等衍生化試劑，雖然能夠精確區(qū)分和測(cè)定D-/L-型賴基酸的含量，但對(duì)儀器精密度和操作人員要求極高，并且易受樣品中雜質(zhì)成分的干擾，不適合工業(yè)發(fā)酵液中賴氨酸的檢測(cè)；化學(xué)法主要指茚三酮方法，基本原理為：氨基酸與水合茚三酮共同加熱后可發(fā)生氧化脫氨反應(yīng)，生成NH3與酮酸；加熱過程中酮酸裂解，放出CO2，自身變?yōu)樯僖粋€(gè)碳的醛，水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。NH3與水合茚三酮及還原茚三酮脫水縮合，生成藍(lán)紫色化合物［12］。傳統(tǒng)的茚三酮檢測(cè)方法無法排除雜質(zhì)氨基酸的干擾，且反應(yīng)過程中易受pH和溫度變化的影響，造成測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性降低［13，14］。本研究在傳統(tǒng)的茚三酮試劑中添加了鐵離子（Fe3+），通過鐵離子對(duì)脯氨酸、鳥氨酸、甘氨酸、精氨酸、組氨酸與茚三酮反應(yīng)的抑制作用，從而提高茚三酮溶液與賴氨酸反應(yīng)的特異性［15］。此外，由于賴氨酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生其他副產(chǎn)物會(huì)影響發(fā)酵液的pH值，對(duì)反應(yīng)的成色速度和產(chǎn)物的顏色造成影響，進(jìn)而削弱了分子內(nèi)基團(tuán)反應(yīng)的靈敏性，所以試驗(yàn)中擬設(shè)計(jì)不同的緩沖液反應(yīng)體系，旨在提高茚三酮法檢測(cè)賴氨酸的特異性，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)賴氨酸發(fā)酵液穩(wěn)定和準(zhǔn)確的檢測(cè)。本方法不需要昂貴的設(shè)備，方法簡單，試劑便宜，數(shù)據(jù)精確，適合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和工業(yè)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 化學(xué)試劑 21種氨基酸，即甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、色氨酸（Trp）、絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）、半胱氨酸（Cys）、蛋氨酸（Met）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、蘇氨酸（Thr）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、組氨酸（His）和鳥氨酸（Ornithine）購自上海生工生物工程有限公司；分析純的茚三酮、氯化鐵、甲基溶纖劑、二甲基亞砜和正己烷購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜純乙酸鈉、異硫氰酸苯酯和三乙胺購自Sigma公司；乙腈由Merck公司提供。

1.1.2 儀器和設(shè)備 酶標(biāo)儀為美國Molecular Devices公司產(chǎn)品，恒溫加熱器購自上海一恒科技有限公司，電子天平（0.000 1 g）購自上海梅特勒-托利多儀器有限公司，高效液相色譜儀購自日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 茚三酮-鐵溶液與氨基酸溶液反應(yīng)［16］首先配制200mmol/L的氨基酸溶液（天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、色氨酸、酪氨酸溶于0.1mol/L的鹽酸，然后用相同體積的0.1mol/L的氫氧化鈉中和，添加去離子水至終濃度200mmol/L；谷氨酰胺由于在酸堿條件下均不穩(wěn)定，故配成飽和溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用；其他氨基酸溶于去離子水）。取20μL氨基酸溶液加入到0.66mL溶液I［373mL甲基溶纖劑與30mL 50％（W/W）

的氯化鐵溶液混合加入600mL緩沖液］和0.37mL溶液II（1 g茚三酮溶于100mL緩沖液）中混合均勻，100℃恒溫加熱40min，快速用自來水冷卻至室溫，加入4mL二甲基亞砜和6mL去離子水，取200μL樣品在480nm波長下（常溫）測(cè)定吸光值。

對(duì)顯色反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間、最佳檢測(cè)波長進(jìn)行了摸索，以確定最佳反應(yīng)條件。另外，還用不同pH值的酸性氯化鉀溶液取代緩沖液來確定溶液顯色反應(yīng)的最佳pH值以及更換不同的緩沖液確定最佳緩沖體系。

1.2.2 高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)賴氨酸生產(chǎn)菌發(fā)酵液中賴氨酸的濃度［17］異硫氰酸苯酯柱前衍生-反相高效液相色譜法測(cè)定賴氨酸：將賴氨酸生產(chǎn)菌的發(fā)酵液分別稀釋20、30和40倍，取出0.4mL置于離心管中，加入1mol/L三乙胺-乙腈溶液0.2mL，異硫氰酸苯酯乙腈溶液0.2mL，漩渦混合器振蕩1min，37℃水浴1h，加入正己烷0.7mL漩渦混合器振蕩1min，靜置60min。用注射器吸取下層溶液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后置于色譜自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，進(jìn)行洗脫和譜圖分析。

2 結(jié)果

2.1 茚三酮法最適檢測(cè)條件的摸索

2.1.1 最佳檢測(cè)波長和最佳pH的確定 200mmol/L賴氨酸與pH為0.8、1.6、2.4、3.2和4.0的茚三酮-鐵混合液反應(yīng)，等體積去離子水取代200mmol/L賴氨酸加入反應(yīng)體系作為對(duì)照，通過酶標(biāo)儀快速讀取吸光值，檢測(cè)結(jié)果見圖1。對(duì)不同pH值的反應(yīng)混合液進(jìn)行了波譜掃描發(fā)現(xiàn)，最佳掃描波長為480nm。當(dāng)pH＞2.4時(shí)，反應(yīng)溶液中出現(xiàn)了沉淀，所以試驗(yàn)選擇在pH＜2.4（即pH為2.2）的環(huán)境中進(jìn)行。

2.1.2 最佳緩沖液的選擇 將不同濃度的賴氨酸溶液（0、50、100、150、200、300、400 和 500mmol/L）與茚三酮-鐵試劑在pH2.2的不同類型的緩沖液體系下進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)480nm處的吸光值。結(jié)果（圖2）顯示，以甘氨酸-鹽酸和鄰苯二甲酸-鹽酸作為反應(yīng)的緩沖液體系時(shí)，產(chǎn)物在480nm處的吸光值始終處于很小數(shù)值范圍內(nèi)，波形比較緩和。而在檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液體系中進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，480nm處的吸光值較強(qiáng)，呈線性分布，說明檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液是比較理想的緩沖試劑。本試驗(yàn)選擇pH2.2 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

圖1 不同pH茚三酮-鐵試劑與200mmol/L賴氨酸反應(yīng)的吸光值

圖2 不同濃度的賴氨酸溶液與茚三酮-鐵試劑在不同緩沖液體系下反應(yīng)結(jié)果

圖3 不同濃度的賴氨酸與茚三酮-鐵試劑在100℃反應(yīng)的變化

2.1.3 最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 選擇線性關(guān)系中賴氨酸濃度最高的200mmol/L溶液，與茚三酮-鐵混合溶液在100℃條件下加熱，每隔5min檢測(cè)反應(yīng)溶液在480nm處的吸光值。結(jié)果（圖3）表明，反應(yīng)結(jié)束達(dá)到穩(wěn)定期需要的時(shí)間基本與賴氨酸濃度成正比。當(dāng)200mmol/L賴氨酸與茚三酮溶液反應(yīng)，在沸水浴中加熱至35min時(shí)拋物線坡度開始變緩，接近最高點(diǎn)，吸光值的線性關(guān)系較好，可以將100℃加熱35min作為200mmol/L賴氨酸完全反應(yīng)的條件；當(dāng)待測(cè)試樣中賴氨酸濃度低于200mmol/L時(shí)，反應(yīng)時(shí)間可以適當(dāng)縮短。

2.2 茚三酮法對(duì)賴氨酸檢測(cè)的特異性與靈敏度

2.2.1 改進(jìn)的茚三酮法對(duì)賴氨酸的特異性檢測(cè) 在pH2.2 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液條件下，采用常見的21種氨基酸（200mmol/L）與茚三酮-鐵試劑反應(yīng)，進(jìn)行350nm-650nm的波譜掃描（圖4），并檢測(cè)480nm處的特異性反應(yīng)（表1），以反應(yīng)體系中去離子水取代氨基酸為對(duì)照。從圖4的波譜掃描結(jié)果可以看出，雖然茚三酮與色氨酸反應(yīng)在390nm處出現(xiàn)最大吸收的波峰，但480nm處吸光值僅為0.02，相反在480nm處只有賴氨酸反應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，其吸收值為0.37，遠(yuǎn)高于其他氨基酸。因此，在pH2.2的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液條件下，茚三酮-鐵試劑對(duì)賴氨酸的反應(yīng)特異性非常強(qiáng)，可以完全排除其他氨基酸的干擾。

2.2.2 改進(jìn)的茚三酮法對(duì)賴氨酸濃度檢測(cè)范圍的確定 配制濃度為0、50、100、150、200、300、400和500mmol/L的賴氨酸溶液與茚三酮-鐵試劑反應(yīng)，100℃加熱1h，測(cè)定產(chǎn)物在480nm處的吸光值。從圖5可以看出，數(shù)值分布趨勢(shì)較明顯，在賴氨酸濃度0-200mmol/L范圍內(nèi)其吸光值與賴氨酸濃度呈非常好的線性關(guān)系（R2=0.9924），因此茚三酮方法測(cè)定的賴氨酸適用濃度范圍為0-200mmol/L。

圖4 21種氨基酸（200mmol/L）與茚三酮-鐵試劑反應(yīng)的波譜掃描

表121種氨基酸（200mmol/L）與茚三酮-鐵試劑反應(yīng)結(jié)果

圖5 不同濃度的賴氨酸與茚三酮-鐵試劑反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 茚三酮-鐵和HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中賴氨酸含量比較

2.2.3 改進(jìn)的茚三酮法與HPLC檢測(cè)法的比較 以本研究室構(gòu)建的一株高產(chǎn)賴氨酸的基因工程大腸桿菌經(jīng)過搖瓶發(fā)酵36h后，12000r/min離心10min去除菌體，發(fā)酵液上清分別采用茚三酮-鐵試劑法和反相高效液相色譜HPLC法檢測(cè)產(chǎn)物賴氨酸的含量。表2中數(shù)據(jù)顯示，茚三酮-鐵試劑檢測(cè)發(fā)酵液中賴氨酸含量與HPLC檢測(cè)結(jié)果幾乎一致，但是HPLC會(huì)出現(xiàn)一定的圖譜重疊（譜圖未給出），分析原因可能為發(fā)酵液中雜質(zhì)氨基酸的干擾。茚三酮-鐵法檢測(cè)賴氨酸的方法可以克服這個(gè)缺點(diǎn)，并且在茚三酮方法簡便易行，對(duì)設(shè)備和試驗(yàn)人員要求低，滿足了工業(yè)發(fā)酵的需要。

3 討論

在改進(jìn)的茚三酮法檢測(cè)賴氨酸的試驗(yàn)過程中，甲基溶纖劑（GDME）和二甲基亞砜（DMSO）作為有效的分散劑和促溶劑，通過加快分子間化學(xué)鍵的形成可以大大促進(jìn)α-氨基酸和茚三酮的反應(yīng)，幫助反應(yīng)溶液中的混合物均勻分布，特別是在高溫反應(yīng)結(jié)束后加入DMSO使數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果更加精確［16］。然而我們?cè)趪L試低濃度賴氨酸（＜10g/L）的測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，若按照上述材料方法中的4mL DMSO和6mL去離子水加入，就會(huì)導(dǎo)致稀釋倍數(shù)過大，檢測(cè)吸光度數(shù)值很小，導(dǎo)致誤差增大，因此可以適當(dāng)減小稀釋倍數(shù)，比如只加1mL DMSO，在480nm下檢測(cè)溶液的吸光值，也會(huì)得到很好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)值分布趨勢(shì)較明顯，在賴氨酸濃度0-6g/L范圍內(nèi)反應(yīng)結(jié)果吸光值與賴氨酸濃度呈線性關(guān)系（R2=0.997），檢測(cè)靈敏度為≤1g/L（數(shù)據(jù)未給出）。

Chinard［15］提出，在強(qiáng)酸性條件下，茚三酮可以與脯氨酸和鳥氨酸反應(yīng)，使溶液呈現(xiàn)紅色；Hsieh等提出，金屬離子（銅、鐵、錫等）能夠抑制茚三酮與脯氨酸、鳥氨酸、甘氨酸、精氨酸和組氨酸的顯色反應(yīng)［16，18］，可以一定程度上排除雜質(zhì)氨基酸的干擾。劉飛飛等［19］在測(cè)定賴氨酸最佳反應(yīng)條件時(shí)發(fā)現(xiàn)加熱時(shí)間過長導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果吸光值下降。此外，據(jù)報(bào)道pH的變化不僅影響到氨基酸和茚三酮反應(yīng)的成色速度和產(chǎn)物的顏色，而且可以影響催化反應(yīng)的機(jī)理，即分子內(nèi)其他一些基團(tuán)對(duì)茚三酮反應(yīng)的靈敏性，但目前仍沒有通過調(diào)節(jié)pH來降低其他氨基酸干擾的報(bào)道。因此，我們嘗試在加入pH2.2的緩沖液和鐵離子后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)茚三酮與賴氨酸反應(yīng)結(jié)束后，吸光值在較長時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，并且反應(yīng)體系的檢測(cè)結(jié)果也非常靈敏。

隨著工業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展，菌種、藥物等目的試樣的快速篩選變得極為重要，這就需要一套有效的高通量篩選技術(shù)來實(shí)現(xiàn)小反應(yīng)體積、高靈敏度和短反應(yīng)時(shí)間的測(cè)定。本研究中介紹的方法，當(dāng)溫度設(shè)置為100℃時(shí)，容易造成溶劑的揮發(fā)，使得反應(yīng)體系體積和樣品濃度發(fā)生變化，影響了高通量的測(cè)定。本研究所建立的設(shè)備完善的高通量篩選平臺(tái)可實(shí)現(xiàn)最高溫度為70℃的恒溫儲(chǔ)藏箱對(duì)樣品進(jìn)行加熱，因此我們嘗試將茚三酮-鐵與賴氨酸的反應(yīng)溫度下調(diào)到70℃，采用200mmol/L的賴氨酸溶液與茚三酮-鐵試劑反應(yīng)，每隔40min檢測(cè)反應(yīng)溶液在480nm處的吸光值，來觀察測(cè)定結(jié)果的變化（數(shù)據(jù)未給出）。結(jié)果顯示，在8h時(shí)拋物線坡度變緩，達(dá)到最高點(diǎn)，即200mmol/L的賴氨酸在70℃需要8h才能反應(yīng)完全，雖然較好地降低了溫度，準(zhǔn)確度較高，但是由于時(shí)間較長，大大限制了高通量檢測(cè)賴氨酸的可行性，所以此方法要想應(yīng)用于高通量測(cè)定還需要進(jìn)一步的改進(jìn)。

4 結(jié)論

本研究對(duì)用于賴氨酸檢測(cè)的茚三酮方法進(jìn)行了改進(jìn)，在pH2.2的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中只有賴氨酸可與茚三酮-鐵試劑發(fā)生480nm處的特征顯色反應(yīng)，其最佳測(cè)定條件為100℃反應(yīng)35min。改進(jìn)的方法不僅可以排除雜氨基酸和有機(jī)酸的干擾，達(dá)到快速準(zhǔn)確特異測(cè)定賴氨酸濃度的目的，而且在工業(yè)發(fā)酵中可作為簡單可行的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)賴氨酸的定性和定量分析。

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