呂嘉榮，沈智杰，王英杰，陳鐵軍，王肖龍

冠心病目前已經(jīng)成為危害人類健康和導(dǎo)致死亡的重要疾病之一，根據(jù)2005年統(tǒng)計(jì)，我國每年死于心血管病的人數(shù)約為300萬，占死亡人數(shù)的45%左右。急性冠脈綜合征（ACS）是冠心病的主要危險(xiǎn)事件，ACS最重要的病理生理機(jī)制是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂引起的血栓形成，致使血管狹窄或閉塞，冠狀循環(huán)發(fā)生障礙，引發(fā)心肌缺血缺氧或壞死。冠脈支架術(shù)是治療冠狀動(dòng)脈狹窄和冠狀動(dòng)脈閉塞最有效的方法之一，而支架內(nèi)血栓形成和再狹窄是支架術(shù)后發(fā)生主要不良心臟事件的重要原因。氯吡格雷是目前冠脈支架術(shù)后預(yù)防再狹窄的一線藥物，但由于氯吡格雷的個(gè)體差異性，部分病人對(duì)其表現(xiàn)為低應(yīng)答甚至無應(yīng)答，即“氯吡 格 雷抵 抗 （CR）”。CR 的 機(jī) 制很 多[1]，目 前認(rèn) 為 與CYP2C19基因多態(tài)性密切相關(guān)。中醫(yī)藥對(duì)氯吡格雷抵抗有其獨(dú)特的優(yōu)勢，臨床研究[2，3]顯示麝香保心丸對(duì)ACS氯吡格雷抵抗病人有效，可降低血小板聚集率等；通心絡(luò)膠囊可以降低ACS病人血漿血小板活化指標(biāo)，減少氯吡格雷抵抗的發(fā)生。本研究通過對(duì)ACS病人證型分布以及基因多態(tài)性研究以探討氯吡格雷抵抗病人證型分布與基因型的關(guān)系，為中醫(yī)藥對(duì)氯吡格雷抵抗病人的干預(yù)研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2012年6月—2013年4月在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院心血管內(nèi)科診斷為急性冠脈綜合征（包括不穩(wěn)定型心絞痛、ST段抬高性心肌梗死、非ST段抬高性心肌梗死）且服用氯吡格雷的病人117例，男88例，女29例，年齡63.74歲±9.91歲。

1.2 試劑和儀器 血液基因組柱式小量提取試劑盒（北京康為世紀(jì)，cw2087），快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒（北京康為世紀(jì)，cw2301），Blend taq plus PCR 酶（日本 Toyobo，BTQ－201），Sma I Fast digest限制性內(nèi)切酶（美國Fermentas，F(xiàn)D0664），Eppendorf Centrifuge 5430R 離心機(jī)（德國eppendorf），Stepone plus PCR儀（美國life technologies），核酸電泳儀、電泳槽（上海天能科技有限公司）凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.3 CYP2C19＊2基因型分析

1.3.1 CYP2C19＊2DNA擴(kuò)增 全血基因組DNA的提?。翰捎肈NA提取試劑盒進(jìn)行DNA抽提。PCR擴(kuò)增：抽取研究對(duì)象靜脈血2mL，EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）抗凝用于提取基因組DNA，共收集病例117例，血樣117份，－80℃保存。CYP2C19基因引物根據(jù)Jean－Sebastien Hulot等文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)：上游引物序列為 5′－CAGAGCTTGGCATATTGTATC－3′，下游引物序列為5′－GTAAACACACAACTAGTCAATG－3′。PCR 體 系 （50 μL）：5μL PCR buffer，5μL dNTP，1μL上游引物，1μL下游引物，1.25Ublend taq Plus酶，1μL DNA模板，無菌超純水35.751μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min→94℃變性30s→56℃退火20s→72℃延伸20s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

1.3.2 PCR的RFLP分析 將2μL酶切buffer，1μL SmaI限制性內(nèi)切酶和17μL回收的PCR產(chǎn)物加入0.5mL離心管中，混勻后在37℃水浴中酶切2h。將酶切產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)將電泳結(jié)果拍照。

1.4 中醫(yī)冠心病證型判定標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥新藥治療胸痹（冠心病心絞痛）的臨床研究指導(dǎo)原則》[5]制定：分為心血瘀阻證、氣虛血瘀證、氣滯血瘀證、痰阻心脈證、陰寒凝滯證、氣陰兩虛證、心腎陰虛證、陽氣虛衰證。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，基因型頻率和等位基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算，基因型與證型分布的關(guān)系行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 PCR－RFLP分析結(jié)果 CYP2C19基因外顯子5中第68 1個(gè)堿基由G突變?yōu)锳，導(dǎo)致SmaI酶切位點(diǎn)消失。利用PCR－RFLP法對(duì)CYP2C19m1進(jìn)行基因分型，野生型CYP2C19純合子（wt／wt）酶切電泳后呈現(xiàn)兩條帶，分別是171bp、113bp；CYP2C19m1突變型純合子（m1／m1）呈一條帶為284bp；CYP2C19wt與CYP2C19m1雜合子（wt／m1）則同時(shí)具備上述3條帶詳見圖1。

圖1 CYP2C19基因分布情況

2.2 各基因型病人的分布情況 氯吡格雷慢代謝型（突變純合子）的基因型頻率為0.085，突變雜合子病人基因型頻率為0.453，正常代謝組（正常純合子）病人基因型頻率為0.462；正常等位基因頻率為0.688，突變等位基因頻率為0.312。詳見表1。

表1 氯吡格雷各基因型病人的分布情況

2.3 急性冠脈綜合征病人中醫(yī)證型分布情況 心血瘀阻證22例（18.8%），氣虛血瘀證60例（51.3%）。氣滯血瘀證11例（9.4%），痰阻心脈證7例（6.0%），陰寒凝滯證3例（2.6%），氣陰兩虛證6例（5.1%）、心腎陰虛證2例（1.7%），陽氣虛衰證6例（5.1%）。各組間經(jīng)卡方檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000），尤以氣虛血瘀證型最為常見。

2.4 證型分布與基因多態(tài)性的關(guān)系（見表2） 各中醫(yī)證型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.718＞0.05），表明證型分布與基因分型無顯著相關(guān)。

表2 ACS病人證型與基因多態(tài)性分布情況例

3 討 論

細(xì)胞色素P450酶系是是由一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的超家族基因（superfamily gene）編碼的同工酶，主要存在于人的肝微粒體中。其中CYP2C19是氯吡格雷主要的代謝酶。CYP2C19＊2、3突變位點(diǎn)對(duì)于氯吡格雷可以減弱其代謝，影響臨床療效。氯吡格雷慢代謝人群比例分布，各地均有報(bào)道[6]，4%～30%不等，國外多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的氯吡格雷抵抗的發(fā)生率波動(dòng)于4.2%～31%，亞洲人群CYP2C19＊2變異型等位基因頻率約為30%，白人約13%，非洲裔美國人約18%。Muller等[7]在105例PCI病例發(fā)現(xiàn)約5%的病人對(duì)氯吡格雷無反應(yīng)，且術(shù)后發(fā)生了血栓形成。王明亮等[8]收集100例急性冠脈綜合征病人，研究發(fā)現(xiàn)氯吡格雷抵抗的病人有23例，發(fā)生率為23%。蔣娟娟等[9]通過對(duì)24名健康受試者口服150mg氯吡格雷，探針法測定CYP2C9，CYP2C19基因型，并通過觀察不同時(shí)間點(diǎn)病人血小板聚集率的變化發(fā)現(xiàn)CYP2C19基因突變者對(duì)氯吡格雷反應(yīng)性降低，其中純合子組和雜合子組的血小板聚集率較野生型均有不同程度降低，且突變純合子組較野生型藥效顯著降低。譚潔等[10]對(duì)江蘇191例PCI術(shù)后病人的研究表明，CYP2C19野生純合型出現(xiàn)氯吡格雷抵抗的概率為11.0%、突變雜合型為29.8%，突變純合型為48.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示氯吡格雷抵抗的發(fā)生與CY2C19基因型有一定相關(guān)性。并有研究[11]表明氯吡格雷的反應(yīng)性與基因型具有量效關(guān)系，攜帶功能缺失等位基因越多，對(duì)氯吡格雷的反應(yīng)性就越差。本研究結(jié)果顯示，氯吡格雷慢代謝型（突變純合子）的人群比例為8.5%，突變雜合子病人比例45.3%，正常代謝組（正常純合子）病人比例為46.2%，正常等位基因頻率為0.688，突變等位基因頻率為0.312。

目前臨床上將冠心病分心血瘀阻證、氣虛血瘀證、氣滯血瘀證等8種證型。而在臨床上單純的一型較少，常常夾有痰濕、痰濁。研究報(bào)道[12]急性冠脈綜合征的中醫(yī)證候有以下特點(diǎn)：實(shí)證多見血瘀證，虛證多見氣虛證。其中血瘀證在實(shí)證里出現(xiàn)的比例達(dá)到90.5%，氣虛為75.6%。王昀等[13]通過對(duì)202例急性冠脈綜合征病人的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，陽虛為急性冠脈綜合征的主要病機(jī)，陽虛及各兼證組比例達(dá)30.8%。張婭等[14]將405例行PCI成功的冠心病病人是否有氣虛血瘀證表型分為氣虛血瘀組和非氣虛血瘀組，發(fā)現(xiàn)氣虛血瘀組CYP2C19＊2基因突變型明顯高于非氣虛血瘀組。陳慧等[15]對(duì)415例血瘀證型的冠心病病人隨訪發(fā)現(xiàn)，重度血瘀證與CYP2C19＊2突變不僅與冠心病病人血小板聚集率相關(guān)，而且增加PCI術(shù)后再發(fā)心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，117例病人中以血瘀證型病人居多，其中氣虛血瘀型病人占51.28%，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)吻合。但證型分布與基因多態(tài)性交叉檢驗(yàn)未見明顯差異，究其原因主要與樣本量有關(guān)。后續(xù)擬進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本，同時(shí)進(jìn)行對(duì)于氣虛血瘀型病人的中藥干預(yù)研究以獲得更多的理論依據(jù)。

研究CYP2C19基因多態(tài)性對(duì)于急性冠脈綜合征早期氯吡格雷抵抗人群的篩查和及早預(yù)防具有一定的指導(dǎo)意義。對(duì)于臨床氯吡格雷抵抗的病人，應(yīng)及早的調(diào)整藥物用量或改換其他抗血小板藥物以預(yù)防支架內(nèi)血栓的形成。同時(shí)，對(duì)于證型分析的研究提示，急性冠脈綜合征病人中，血瘀證為主導(dǎo)證型，尤其以氣虛血瘀型表現(xiàn)最為顯著，故中西醫(yī)結(jié)合治療以益氣活血藥物輔助干預(yù)為宜。

[1]郭麗敏，崔煒，楊曉紅，等.氯吡格雷抵抗的發(fā)生率及其影響因素[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（4）：497－500.

[2]張景，李云波.麝香保心丸對(duì)急性冠脈綜合征病人氯吡格雷抵抗的影響[J].求醫(yī)問藥.2012，10（6）：91－92.

[3]張萍，白如冰，馬洪山.通心絡(luò)膠囊對(duì)急性冠脈綜合征病人氯吡格雷抵抗的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010，8（9）：1037－1038.

[4]Hulot JS，Bura A，Villard E，et al.Cytochrome P4502C19loss－offunction polymorophism is a major determination of clopidogerl responsiveness in healthy subjects[J].Blood，2006，108（7）：2244－2247.

[5]鄭筱萸.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002：62－69.

[6]Desta Z，Zhao X，Shin JG，et al.Clinical significance of the cytochrome P450 2C19genetic polymorphism[J].Clin Pharmacokinet，2002，41：913－958.

[7]Muller I，Besta F，Schulz C，et al.Prevalence of clopidog relnonresponders among patients with stable angina pectoris scheduled fore lective coronary stent placement[J].Thromb Haemost，2003，89（5）：783－787.

[8]王明亮，朱毅，甘潔民.急性冠脈綜合征病人中氯吡格雷抵抗的發(fā)生率及影響因素[J].中國臨床藥學(xué)雜志，2010，19（3）：142－144.

[9]蔣娟娟，田蕾，韓璐璐.CYP2C9和CYP2C19基因多態(tài)性對(duì)健康中國人口服氯吡格雷后藥效動(dòng)力學(xué)的影響[J].中國新藥雜志，2011，20（13）：1217－1221.

[10]譚潔，劉彥，林琳.經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后病人CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的相關(guān)性研究[J].臨床心血管病雜志，2013，29（2）：209－211.

[11]張昌琳.細(xì)胞色素P4502C19多態(tài)性與對(duì)氯吡格雷的反應(yīng)性研究進(jìn)展[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2011，32（6）：858－862.

[12]張小紅.益氣活血法治療氣虛血瘀型心絞痛32例[J].陜西中醫(yī)，2009，30（10）：1279－1280.

[13]王昀，王瑱，孔令越，等.急性冠狀動(dòng)脈綜合征中醫(yī)證候分布規(guī)律研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，35（2）：139－141.

[14]張婭，陳慧，李燦東，等.冠脈介入術(shù)后氣虛血瘀證與CYP2C19＊2基因多態(tài)性的相關(guān)性研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（11）：2521－2524.