田亞寧 周智輝 梁漫 董昌虎 何春玲 仝航斌 李宏

人表皮干細胞的分離培養(yǎng)

田亞寧 周智輝 梁漫 董昌虎 何春玲 仝航斌 李宏

目的 探索人表皮干細胞原代培養(yǎng)方法。方法 將皮膚標本進行分離, 用DispaseⅡ酶消化表皮皮片后, 重懸細胞, 接種于鋪有Ⅳ型膠原的培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)。表皮干細胞的鑒定采用免疫細胞化學技術(shù)檢測其表面標記物β1整合素、CK19的表達。對表皮干細胞與角質(zhì)形成細胞的克隆形成情況進行比較。結(jié)果 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀況良好, 表皮干細胞β1整合素及CK19角蛋白染色陽性。表皮干細胞克隆形成率高于角質(zhì)形成細胞(P＜0.05)。結(jié)論 采用本方法進行人表皮干細胞的培養(yǎng)較為理想。

表皮干細胞；培養(yǎng)；鑒定

表皮干細胞具有無限增殖的能力, 在組織工程皮膚的研究中具有重要的作用,本文就表皮干細胞的原代培養(yǎng)進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium, DMEM), 單克隆抗體β1整合素, 單克隆抗體CK19, Ⅳ型膠原, DispaseⅡ酶, 胎牛血清(FBS), 表皮細胞生長因子, 0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)。

1.2 實驗設備 CO2恒溫培養(yǎng)箱, 無菌超凈工作臺, 倒置相差顯微鏡, 普通光學顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 原代培養(yǎng) 嚴格無菌操作, 切取5×5 mm2左右的皮膚標本, 標本源自本院4月齡自愿引產(chǎn)胎兒包皮, 切取前分離皮下組織, 將分離得到的皮膚組織用含青-鏈霉素的PBS沖洗3次, 切成小皮塊后置于含2.5 mg/ml DispaseⅡ酶的DMEM培養(yǎng)基中4℃過夜, 培養(yǎng)基中含有青霉素(100 U/ml)及鏈霉素(100 μg/ml), 第二天分離表皮和真皮層, 收集表皮皮片, 37℃條件下0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化15 min, 胎牛血清終止消化, 輕輕吹打, 200目篩網(wǎng)過濾, 收集細胞懸液, 1000 rpm離心5 min, 棄上清, 加入新鮮培養(yǎng)液(DMEM表皮干細胞完全培養(yǎng)液含10%的FBS, 10 μg/L 的表皮細胞生長因子, L-谷氨酰胺0.1 mM, 非必需氨基酸0.1 mM), 重懸細胞, 計數(shù), 調(diào)整細胞濃度至5×105個/ml, 種植于鋪有Ⅳ型膠原的培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)(37℃, 5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱),培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板等均用Ⅳ型膠原預先鋪好, 并用加有雙抗的DMEM培養(yǎng)液輕輕清洗1次。每3天換1次液, 并在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況及有無其他病原體污染, 對于未貼壁的細胞輕輕吸出作為角質(zhì)細胞對照組加入相同的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

1.3.2 傳代培養(yǎng) 細胞長至80%融合以后, 經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化5 min左右, 終止消化, 用吸管輕輕吹打貼壁細胞,收集細胞懸液, 1000 rpm離心5 min, 棄上清, 重懸細胞, 計數(shù)。按1:3比例進行傳代, 于37℃ 5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況, 根據(jù)生長狀況進行換液。

1.3.3 免疫化學染色 細胞貼片, PBS洗滌, 4%多聚甲醛固定20 min, 采用SP法按照試劑的使用說明步驟進行β1整合素、CK19的免疫細胞化學染色檢測, 滴加一抗、二抗后, DAB顯色, 復染、脫水、透明、封片, 鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析, 克隆形成數(shù)目用(±s)表示, 表皮干細胞與角質(zhì)細胞克隆形成的比較采用配對t檢驗, P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

細胞生長狀況良好, 貼壁率較高, 沒有其他病原體的污染, 在倒置相差顯微鏡下觀察貼壁的表皮干細胞, 呈圓形或多角形, 體積較小, 培養(yǎng)14 d左右形成較大克隆。經(jīng)免疫細胞化學染色后, 表皮干細胞標記物β1整合素、CK19均呈陽性反應。

細胞克隆形成率測定：取第2代表皮干細胞及角質(zhì)細胞,分別制備單細胞懸液, 按200個細胞/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)2周, 應用吉姆薩染色方法, 鏡下觀察細胞克隆形成情況并計數(shù), 克隆形成率=細胞克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%, 以角質(zhì)細胞作對照。表皮干細胞與角質(zhì)細胞克隆形成情況比較如表1所示。

表1 表皮干細胞與角質(zhì)細胞克隆形成情況比較

應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析, 行配對t檢驗, t=9.88, P＜0.05, 差異具有統(tǒng)計學意義, 即表皮干細胞克隆形成率高于角質(zhì)形成細胞。

3 討論

隨著燒傷、創(chuàng)傷等疾病的明顯上升, 外科手術(shù)對于皮膚組織的需求也相應增加, 自體皮膚移植往往受到限制, 組織工程皮膚的研發(fā)具有重要的臨床應用價值。目前, 構(gòu)建理想的人工皮膚成為本領域研究的一大熱點。由于表皮干細胞具有無限增殖的能力, 因此, 在人工皮膚的研究中具有重要作用。表皮干細胞的分離培養(yǎng)方法多樣, 用于鑒定表皮干細胞的標記物有很多, 但某些標記分子缺乏特異性, 如何篩選特異性的標記分子來區(qū)分表皮干細胞顯得尤為必要。

正常的皮膚分為表皮和真皮, 其中表皮分為5層, 由內(nèi)向外依次為基底層、棘細胞層、顆粒細胞層、透明細胞層和角質(zhì)細胞層?；准毎挥诒砥ぷ顑?nèi)層的基底膜上, 而表皮干細胞則存在于表皮的基底層和毛囊的隆突部, 大多數(shù)情況下, 表皮干細胞處于靜息狀態(tài), 在受到創(chuàng)傷或理化等因素刺激下可激活, 可增殖分化為表皮中各種細胞成分, 保持皮膚正常的表皮結(jié)構(gòu)。由于表皮干細胞具有無限增殖的能力, 因此, 可用于組織工程皮膚的研究中。表皮干細胞的原代培養(yǎng)可采用膠原快速粘附, 可使表皮干細胞及時貼壁生長, 在培養(yǎng)過程中, 為防止病原體的污染, 可在組織分離過程以及完全培養(yǎng)液中加入青霉素及鏈霉素等。目前, 表皮干細胞的鑒定主要依據(jù)其表面特異性的標記分子, 研究表明：CD34可作為小鼠干細胞的表面標記, 而人的毛囊區(qū)也有CD34的表達［1］。角蛋白14和15、 α6整合素［2,3］、β1整合素［4］以及CK19［5］等均為表皮干細胞的標記分子。而表皮干細胞的特異性標記物還有待進一步研究證實, 才能將其與其他角朊細胞區(qū)分開來。

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Isolation and culture methods of human epidermal stem cells

Tian Ya-ning, Zhou Zhihui, Liang Man, et al.
Second Affiliated Hospital of Shanxi University of traditional Chinese medi cine, Xian yang 712000, China

Objective The present research was performed to find primary cell culture method of human epidermal stem cells. Methods The skin samples were isolated by Dispase Ⅱ, the cells were seeded in culture flask which was dealed with type IV collagen. The epidermal stem cells were identified by immunocytochemical technique for the detection of integrin β1and CK19. The cell clone formation of epidermal stem cells and keratinocyte were compared. Results Cell morphology was observed under microscope and good growth status inverted, epidermal stem cells were positive reaction to integrin β1and CK19 antibody. Epidermal stem cell clone formation rate is higher than that of keratinocytes (P＜0.05).Conclusion Our results indicate that the method was effective for culture human epidermal stem cells.

Epidermal stem cell; Culture; Identification

陜西省教育廳專項科研計劃項目(項目編號：2010JK515)

712000 咸陽, 陜西中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院

李宏