人全血培養(yǎng)方法篩選抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎青藤堿衍生物

王悅

人全血培養(yǎng)方法篩選抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎青藤堿衍生物

王悅

目的 通過(guò)人全血培養(yǎng)方法篩選有潛在抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用的青藤堿衍生物。方法 細(xì)菌酯多糖(LPS)刺激人全血誘導(dǎo)TNF-α產(chǎn)生, 加入青藤堿衍生物, ELISA法檢測(cè)其對(duì)TNF-α生成的抑制作用。結(jié)果 濃度為10～4 mol/L 時(shí), 青藤堿衍生物SIN-3、SIN-33對(duì)TNF-α的抑制率分別為22.9%和31.1%, 其中SIN-33的抑制作用明顯比強(qiáng)于青藤堿(24.2%)， P＜0.05。結(jié)論 青藤堿衍生物SIN-33可明顯抑制人全血中LPS誘導(dǎo)的TNF-α的生成, 可作為抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎候選藥物進(jìn)一步研究。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；青藤堿；人全血培養(yǎng)；TNF-α

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性自身免疫性疾病, 目前通常采用非甾體類抗炎藥對(duì)癥治療以及各種抗風(fēng)濕藥物對(duì)疾病進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此, 臨床上急需可同時(shí)調(diào)節(jié)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀和進(jìn)程的小分子藥物。

青藤堿(sinomenine, SIN)是從中藥青藤中提取的, 可抑制或治療炎癥、免疫反應(yīng)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。研究顯示青藤堿可降低體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)［1］。本研究中根據(jù)文獻(xiàn)對(duì)青藤堿C環(huán)和D環(huán)進(jìn)行了修飾得到兩個(gè)化合物(圖1), 然后通過(guò)人全血方法檢測(cè)對(duì)LPS刺激人全血后產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF-α)的抑制作用, 并與青藤堿進(jìn)行比較。

圖1 青藤堿衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

① 實(shí)驗(yàn)材料

青藤堿衍生物SIN-3和SIN-33(上海睿智化學(xué)研究有限公司合成)；青藤堿(＞99%, 陜西華昌生物工程公司)；LPS (Sigma公司)；人腫瘤壞死因子(TNF-α)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(R&D 公司)。

② 實(shí)驗(yàn)方法

從7名健康志愿者末梢靜脈抽取100 μl外周血注入含EDTA無(wú)內(nèi)毒素的采血管中, 放置1 h, 用 900 μl 的 RPMI 1640 (含10% 胎牛血清)對(duì)其進(jìn)行稀釋。把1μl SIN-3、SIN-33和SIN(10～4 mol/l)的二甲基亞砜溶液放入二十四孔板中, 每個(gè)樣品重復(fù)雙孔, 于37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)15 min。然后除對(duì)照組外, 采用10 μl LPS(1 μg/ml)同樣在37 ℃, 5% CO2下孵育6 h, 最后把培養(yǎng)板在冰浴上以終止反應(yīng)。培養(yǎng)板在4℃以1500 rpm離心10 min, 吸取上清液, 采用人酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)試劑盒來(lái)檢測(cè)其中TNF-α含量, 計(jì)算各孔TNF-α含量變化的百分?jǐn)?shù)。數(shù)據(jù)用(±s)E表示, 采用SPSS16.0軟件單因素方差分析進(jìn)行組間比較, P＜0.05時(shí)具有顯著性差異。

3 結(jié)果

LPS刺激后, 人全血釋放TNF-α的濃度為1868 pg/ml,而對(duì)照孔中TNF-α含量接近于零。如圖2顯示, 當(dāng)濃度為10～4mol/L 時(shí), SIN-3和SIN-33均可抑制TNF-α產(chǎn)生, 抑制率分別為22.9%和31.1%, 其中SIN-33明顯比SIN 24.2%高(P＜0.05)。

圖2 青藤堿衍生物在人全血中對(duì)TNF-α的抑制率(n=7)與SIN組比較,aP＜0.05

4 討論

本研究中我們通過(guò)人全血方法比較青藤堿衍生物和青藤堿對(duì)LPS刺激產(chǎn)生TNF-α的抑制作用。LPS 是革蘭氏陰性菌的主要成分, 常用于單核細(xì)胞等細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的強(qiáng)力刺激物質(zhì)［1］, 此方法目前為世界上公認(rèn)的評(píng)價(jià)抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎新藥的金標(biāo)準(zhǔn)。

TNF-α 是LPS刺激后產(chǎn)生最多的介導(dǎo)因子, 是抗關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程的重要因子。有研究顯示青藤堿減少TNF-α可能是其產(chǎn)生抗炎癥作用的主要機(jī)制［2］。

本研究數(shù)據(jù)顯示SIN-33在人全血中可誘導(dǎo)TNF-α的分泌, 說(shuō)明它可成為新的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎新藥的候選藥物,其抗關(guān)節(jié)炎作用可能也是由于抑制炎癥因子如TNF-α的表達(dá)所引起。

［1］ Franchimont D, Louis E, Dewe W, et al. Effects of dexamethasone on the profile of cytokine secretion in human whole blood cell cultures. Regulatory Peptides. 1998(73): 59-65.

［2］ Zhou H, Wong YF, Wang J, et al. Sinomenine ameliorates arthritis via MMPs, TIMPs and cytokines in rats. Biochemical and Biophysical research communications, 2008(376): 352-357.

210029 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院