任 鈺， 孟 美， 王化宇， 張煒煜

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130117)

丹參為唇型科植物丹參Salvia mitiorrhiza Bge．的干燥根及根莖［1］，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效［2-3］。其脂溶性成分為丹參酮類成分，主要有丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮等，其中含丹參酮ⅡA量相對(duì)較多，約為0.1% ～0.9%［4］。現(xiàn)代藥理研究表明［5-7］，丹參酮具有預(yù)防心腦血管疾病、抗肝纖維化、改善肝臟微循環(huán)、抗真菌、抗血小板聚集及神經(jīng)保護(hù)作用等多種藥理作用。但丹參酮屬于菲醌類衍生物，在溶液中光照易發(fā)生光化反應(yīng)而被破壞［8］，故本實(shí)驗(yàn)采用避光乙醇回流提取法進(jìn)行提取，以大孔樹(shù)脂對(duì)丹參脂溶性提取部位進(jìn)行純化，考察了大孔樹(shù)脂純化丹參酮提取物的工藝參數(shù)，以期獲得符合新藥申報(bào)規(guī)定要求的丹參酮純化物，為丹參的相關(guān)制劑的生產(chǎn)提供可靠的依據(jù)。

1 儀器與試藥

丹參 (河南聚仁中藥飲片有限公司，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室姜大成教授鑒定為唇形科植物丹參的根，批號(hào):110310);丹參酮ⅡA對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):110766-200518);隱丹參酮對(duì)照品 (中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):110852-200305);甲醇 (Sigma公司，色譜純);乙腈 (Sigma公司，色譜純);乙醇(北京化工廠，分析純);AB-8大孔吸附樹(shù)脂、D101大孔吸附樹(shù)脂、S-8大孔吸附樹(shù)脂、HPD100大孔吸附樹(shù)脂、X-5大孔吸附樹(shù)脂 (滄州寶恩吸附材料科技有限公司)。

Agilent 1200Series高效液相色譜儀 (美國(guó)安捷倫公司);Agilent VWD型檢測(cè)器 (美國(guó)安捷倫公司);KQ2200B型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);JA5103N電子天平 (上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司);UV—9200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (北京瑞利分析儀器公司);DZF-6050型真空干燥箱 (上海一恒科技有限公司);RE—52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參粗提液的制備 采用本課題組實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的丹參最佳提取工藝(《正交試驗(yàn)優(yōu)選丹參中丹參酮提取物的提取工藝》待發(fā)表)進(jìn)行提取，取丹參藥材1 kg，加6倍于藥材量的80%的乙醇避光加熱回流提取一次，提取時(shí)間0.5 h，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至無(wú)醇味。將提取液轉(zhuǎn)移至1 000 mL的量瓶，加蒸餾水定容至刻度，得到粗提液的質(zhì)量濃度為1 g生藥/mL，備用。

2.2 隱丹參酮和丹參酮ⅡA的測(cè)定方法的建立

2.2.1 色譜條件 Agilent Zorbox SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相為乙腈 (A)-0.05%磷酸溶液 (B)，按下表1進(jìn)行梯度洗脫;體積流量為1.2 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm;柱溫為25℃。理論塔板數(shù)以隱丹參酮計(jì)不低于20 000。

表1 梯度洗脫流動(dòng)相Tab.1 Gradient elution of mobile phase

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取隱丹參酮對(duì)照品約1 mg和丹參酮ⅡA對(duì)照品約2.5 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇適量，振搖使溶解，甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含隱丹參酮0.093 0 mg和丹參酮ⅡA0.266 4 mg的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品約5 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.05、0.5、1、3、5 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液;分別將不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液進(jìn)樣10μL測(cè)定，記錄峰面積，以對(duì)照品峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度 (X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。隱丹參酮的回歸方程為Y=55 091X－24.68，r=0.999 8;丹參酮ⅡA的回歸方程為Y=72 473X－109.5，r=0.999 8。表明隱丹參酮在0.000 93～0.093 00 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系;丹參酮ⅡA在0.002 664～0.266 400 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 分別取兩批平行的樣品3份，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)行測(cè)定。隱丹參酮和丹參酮ⅡA的RSD分別為0.37%、0.34%，結(jié)果表明測(cè)定方法精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)行測(cè)定。隱丹參酮和丹參酮ⅡA的 RSD分別為0.35%、0.35%，結(jié)果表明測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在本試驗(yàn)條件下，取供試品溶液分別在室溫放置0、2、4、6、8、12 h，依法進(jìn)行測(cè)定。隱丹參酮和丹參酮ⅡA的RSD分別為0.67%、0.55%，結(jié)果表明供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密吸取已知量的供試品溶液6份，分別精密加入0.029 40 mg隱丹參酮、0.087 02 mg丹參酮ⅡA的丹參酮對(duì)照品溶液，依法進(jìn)行測(cè)定，按公式 ［加入對(duì)照品后測(cè)得總量－樣品中所含被測(cè)組分量)/加入對(duì)照品量×100%計(jì)算回收率。隱丹參酮和丹參酮ⅡA平均回收率分別為99.78%、97.89%，結(jié)果表明本方法測(cè)定隱丹參酮和丹參酮ⅡA的回收率良好。

2.2.9 樣品測(cè)定 取待測(cè)樣品，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，用0.22μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，進(jìn)樣量10μL，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，根據(jù)各回歸方程計(jì)算隱丹參酮和丹參酮ⅡA的量。

2.3 樹(shù)脂的選擇

2.3.1 樹(shù)脂的預(yù)處理 取適量S-8、AB-8、HPD-10、X-5、D-101樹(shù)脂，乙醇浸泡24 h，裝柱，乙醇洗至流出液加等量去離子水后幾乎無(wú)白色渾濁為止，去離子水洗至無(wú)醇味，備用。

2.3.2 樹(shù)脂類型的篩選

2.3.2.1 靜態(tài)吸附試驗(yàn) 分別準(zhǔn)確稱取上述5種處理好的大孔吸附樹(shù)脂2.0 g，置于100 mL的廣口瓶中。再準(zhǔn)確稱取丹參粗提液5份，每份0.2 g，分別加入50 mL乙醇溶解，將溶液置于盛有大孔吸附樹(shù)脂的廣口瓶中，25℃恒溫水浴振蕩24 h，使大孔樹(shù)脂充分吸附。準(zhǔn)確量取吸附液25 mL，置于50 mL蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，加甲醇溶解，稀釋至25 mL，采用HPLC測(cè)定丹參酮ⅡA和隱丹參酮的量，計(jì)算其吸附率。吸附量=［(初始質(zhì)量濃度－吸附后質(zhì)量濃度)×吸附液體積］;吸附率(%)=［吸附量/初始樣品量］×100%。

2.3.2.2 靜態(tài)解吸附試驗(yàn) 充分吸附后的大孔樹(shù)脂中加50 mL 70%乙醇，25℃恒溫水浴振搖24 h，準(zhǔn)確量取5 mL解吸液，置于50 mL蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，加甲醇溶解，稀釋至25 mL，采用HPLC測(cè)定丹參酮ⅡA和隱丹參酮的量，計(jì)算其解吸率，確定最佳樹(shù)脂。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 大孔吸附樹(shù)脂篩選結(jié)果Tab.2 Screening results of macroporous adsorption resin

結(jié)果表明，綜合隱丹參酮和丹參酮ⅡA的吸附率、洗脫率，X-5型大孔吸附樹(shù)脂較好，因此，試驗(yàn)選擇X-5型樹(shù)脂。

2.4 動(dòng)態(tài)吸附工藝研究

2.4.1 上樣液質(zhì)量濃度的考察 將預(yù)處理后的X-5樹(shù)脂濕法裝柱，分別考察0.1、0.2、0.4、0.8 g生藥/mL的上樣液質(zhì)量濃度，2 mL/min體積流量上樣3.5 mL(0.5 BV，試驗(yàn)選用層析柱柱體積為7 mL)，吸附2 h后，以2 mL/min體積流量70%乙醇洗脫5 BV，收集流出液，水浴蒸干，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用HPLC測(cè)定丹參酮ⅡA和隱丹參酮的量，計(jì)算其洗脫率，確定最佳上樣液質(zhì)量濃度。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 上樣液質(zhì)量濃度考察結(jié)果Tab.3 Investigation results of sam p le concentration

結(jié)果表明，上樣液質(zhì)量濃度對(duì)丹參酮ⅡA和隱丹參酮洗脫率有一定影響，上樣液質(zhì)量濃度為0.2g生藥/mL較好。因此，試驗(yàn)選擇上樣液質(zhì)量濃度為0.2 g生藥/mL。

2.4.2 泄露曲線的考察 將預(yù)處理后的X-5樹(shù)脂濕法裝柱，0.2 g生藥/mL上樣液以2 mL/min的體積流量上樣5 BV，每0.5 BV接收流出液，收集流出液，水浴蒸干。按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用HPLC測(cè)定流出液中丹參酮ⅡA和隱丹參酮的量，計(jì)算其流出液中質(zhì)量濃度，流出液質(zhì)量濃度為上樣液質(zhì)量濃度的10%時(shí)，即為X-5型樹(shù)脂對(duì)丹參粗提液的吸附泄露點(diǎn)，此時(shí)上樣體積即為最佳上樣量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 吸附泄露點(diǎn)測(cè)定結(jié)果Tab.4 Adsorption of leak point determination results

結(jié)果表明，隱丹參酮、丹參酮ⅡA上樣質(zhì)量濃度分別為1.129、0.786 mg/mL。上樣量為3.5 BV時(shí)，隱丹參酮泄露質(zhì)量濃度為0.115 mg/mL，接近上樣液質(zhì)量濃度的10%，上樣量為4.5 BV時(shí)，丹參酮ⅡA泄露質(zhì)量濃度為0.071 mg/mL，接近上樣液質(zhì)量濃度的10%。因此，試驗(yàn)選擇4.5 BV為丹參酮提取液最佳上樣量。

2.4.3 上樣速度的考察 將預(yù)處理后的X-5樹(shù)脂濕法裝柱，分別考察 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min的上樣體積流量，以0.2 g生藥/mL上樣液上樣4.5 BV，吸附2 h后，以2 mL/min體積流量水洗脫3 BV、70%乙醇洗脫5 BV，收集流出液，水浴蒸干。按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用HPLC測(cè)定丹參酮ⅡA和隱丹參酮的量，計(jì)算洗脫率，確定最佳上樣速度。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 上樣速度考察結(jié)果Tab.5 Investigation results of samp le rate

結(jié)果表明，隨著上樣速度逐漸增大，隱丹參酮和丹參酮ⅡA洗脫率先增大后減小，上樣體積流量為3 mL/min時(shí)較好，因此，試驗(yàn)選擇3 mL/min為最佳上樣體積流量。

2.4.4 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的考察 將預(yù)處理后的X-5樹(shù)脂濕法裝柱，分別考察75%、80%、85%、90%、95%體積分?jǐn)?shù)的乙醇。以0.2 g生藥/mL上樣液3 mL/min上樣4.5 BV，吸附2 h后，以2 mL/min體積流量水洗脫3 BV、不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫5 BV，接受流出液，水浴蒸干。按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用HPLC測(cè)定丹參酮ⅡA和隱丹參酮的量，計(jì)算洗脫率，確定最佳洗脫劑體積分?jǐn)?shù)。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)考察結(jié)果Tab.6 Investigation results of eluent concentration

結(jié)果表明，隨著洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，隱丹參酮和丹參酮ⅡA洗脫率逐漸增大，當(dāng)洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)大于90%時(shí)，隱丹參酮和丹參酮ⅡA洗脫率變化不大，因此，試驗(yàn)確定90%乙醇為洗脫劑。

2.4.5 洗脫速度的考察 將預(yù)處理后的X-5樹(shù)脂濕法裝柱，分別考察 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min的上樣體積流量。以0.2 g生藥/mL上樣液3 mL/min上樣 4.5 BV，吸附 2 h后，以 2 mL/min體積流量水洗脫3 BV，90%乙醇不同速度洗脫5 BV，接受流出液，水浴蒸干。按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用HPLC測(cè)定丹參酮ⅡA和隱丹參酮的量，計(jì)算洗脫率，確定最佳洗脫體積流量。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 洗脫速度考察結(jié)果Tab.7 Investigation results of elution rate

結(jié)果表明，洗脫體積流量太慢，容易將雜質(zhì)洗脫，洗脫體積流量太快，則洗脫劑不能完全接觸吸附物，洗脫不完全。當(dāng)洗脫體積流量為2 mL/min時(shí)較好，因此，試驗(yàn)選擇2 mL/min為最佳洗脫體積流量。

2.4.6 洗脫劑用量的考察 將預(yù)處理后的X-5樹(shù)脂濕法裝柱，以0.2 g生藥/mL上樣液3 mL/min上樣4.5 BV，吸附2 h后，以2 mL/min體積流量水洗脫3 BV、90%乙醇洗脫10 BV，每1 BV接收洗脫液，水浴蒸干。按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用HPLC測(cè)定丹參酮ⅡA和隱丹參酮的量，計(jì)算洗脫量，確定洗脫劑用量。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 洗脫劑用量考察結(jié)果Fig.1 Investigation results of eluting agent

結(jié)果表明，洗脫劑用量增加至8 BV時(shí)，隱丹參酮和丹參酮ⅡA洗脫量接近于0，因此，試驗(yàn)選擇最佳洗脫劑用量為8 BV。

2.5 丹參酮粗提液純化工藝驗(yàn)證性試驗(yàn) 選擇500 mL層析柱，將預(yù)處理后的X-5樹(shù)脂濕法裝柱，以0.2 g生藥/mL上樣液3 mL/min上樣4.5 BV，吸附3 h后，以2 mL/min水洗3 BV、90%乙醇洗脫8 BV，接受流出液，濃縮、干燥至恒定質(zhì)量，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用HPLC測(cè)定丹參酮ⅡA和隱丹參酮的量，計(jì)算洗脫率、純度，平行驗(yàn)證3次。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 最佳工藝驗(yàn)證結(jié)果Tab.8 Validation results of optimum technology

結(jié)果表明，丹參酮平均純度為54.78%，RSD為0.17%，隱丹參酮平均洗脫率為90.18%，RSD為0.34%;丹參酮ⅡA平均洗脫率為87.64%，RSD為0.84%。工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

試驗(yàn)曾對(duì)大孔吸附樹(shù)脂殘留物的含量進(jìn)行檢查，按《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版二部附錄VIII P殘留溶劑測(cè)定法要求對(duì)苯乙烯骨架型大孔吸附樹(shù)脂通常做6種殘留物的項(xiàng)目檢查，包括甲苯、二甲苯、二乙烯基苯、烷烴類、苯乙烯和苯。本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜法對(duì)洗脫液中的一種主要成分苯乙烯做了檢測(cè)。結(jié)果在苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品的位置上。乙醇洗脫液沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的峰，且乙醇洗脫液與空白洗脫液的峰形一致。表明大孔吸附樹(shù)脂的洗脫液中不含有苯乙烯類雜質(zhì)成分，樹(shù)脂洗脫完全，符合《中國(guó)藥典》規(guī)定。

丹參酮ⅡA對(duì)光、熱均較敏感，溶液中光照、高溫條件下易分解，本實(shí)驗(yàn)考察了丹參酮提取物干燥溫度，發(fā)現(xiàn)丹參酮提取物中丹參酮ⅡA在50℃下干燥較穩(wěn)定，60℃下?lián)p失率為24.87%。因此，丹參酮提取、干燥過(guò)程中，選擇避光、合適的溫度非常必要，但由于大工業(yè)生產(chǎn)時(shí)采用多功能提取罐，提取罐本身是密閉的，因此在實(shí)驗(yàn)室采用避光回流提取。

大孔樹(shù)脂具有吸附性強(qiáng)、吸附空間大、容易吸附洗脫、機(jī)械強(qiáng)度好、可回收再利用和流體阻力小等優(yōu)點(diǎn)，可以替代傳統(tǒng)的有機(jī)試劑純化方法，在藥物有效成分的純化中應(yīng)用廣泛，適合于大工業(yè)生產(chǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)幾種常用的大孔吸附樹(shù)脂吸附、洗脫能力的比較，篩選出X-5型大孔樹(shù)脂用于丹參中丹參酮提取物純化，表明該大孔樹(shù)脂能夠有效地對(duì)丹參酮提取物進(jìn)行富集。優(yōu)選工藝條件下丹參中丹參酮提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到54.78%，符合申報(bào)新藥中要求有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到50%以上。本工藝簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可行性高，為含丹參酮ⅡA制劑的研究奠定了基礎(chǔ)。

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