汪坤福 朱貴明 張 濤 孫 潔 江旭東 王明富 (佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

多不飽和脂肪酸(PUFAs)在人體中具有重要的生理功能，特別是二十二碳六烯酸(DHA)、二十五碳五烯酸(EPA)等長鏈ω-3 PUFAs在促進大腦發(fā)育和功能維持以及在預防和治療心血管疾病、炎癥、癌癥等多種疾病方面有著重要作用〔1，2〕。然而，人類及其他哺乳動物由于自身一些脂肪酸合成酶活性(例如Δ4-脂肪酸去飽和酶和Δ15-脂肪酸去飽和酶)的缺失導致其合成長鏈ω-3 PUFAs的能力很低，因此主要依靠從食物來源獲取這類特殊的脂肪酸〔3〕。一種原生動物Euglena gracilis的Δ4-脂肪酸去飽和酶的編碼基因在酵母中表達后能將EPA直接轉(zhuǎn)變?yōu)镈HA〔4〕。如果該酶活性能夠在哺乳動物中實現(xiàn)表達，極有可能大大地提高哺乳動物DHA的水平。本研究擬構(gòu)建Δ4-脂肪酸去飽和酶基因的哺乳動物表達載體，然后轉(zhuǎn)染到哺乳動物中國倉鼠卵巢細胞(CHO)中，考察該基因在哺乳動物中RNA水平的表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌(DH5ɑ)、質(zhì)粒pcDNA3.1(-)為本實驗室保存。CHO細胞購于中國協(xié)和醫(yī)科大學。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、RT-PCR試劑盒等購于寶生物工程(大連)有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、基因組提取試劑盒等購于天根生化科技(北京)有限公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。細胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基、血清、培養(yǎng)皿等為Hyclone產(chǎn)品。

1.2 Δ4-脂肪酸去飽和酶基因密碼子的優(yōu)化及合成 將原生動物Δ4-脂肪酸去飽和酶基因的密碼子進行改造和優(yōu)化設計，并按照優(yōu)化設計后的基因序列進行人工合成全長基因(命名為D4，以下簡稱D4基因)。合成的基因連接到pMD18-T克隆載體，形成重組質(zhì)粒pMD18T-D4。合成基因兩端帶有EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切位點。

1.3 D4基因克隆到真核表達載體pcDNA3.1(-) 將重組質(zhì)粒pMD18T-D4與pcDNA3.1(-)一起用EcoRⅠ和HindⅢ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物利用膠回收試劑盒回收，再用DNA連接酶16℃過夜連接，次日取出連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5ɑ，利用質(zhì)粒電泳、酶切及測序等方法篩選和鑒定重組質(zhì)粒的陽性克隆。

1.4 pcDNA3.1-D4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細胞及其表達 將pcDNA3.1-D4重組質(zhì)粒用SalⅠ和BglⅡ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物利用膠回收試劑盒回收，采用脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染CHO細胞，用G418篩選1個月。收集細胞提取基因組DNA，用PCR方法鑒定基因整合情況。提取總RNA，RT-PCR檢測D4基因表達情況?；蚪M和 RT-PCR的檢測引物一致:上游引物D4d-s:5'TCATCATCAACCACATCAGCGAG 3'，下游引物 D4-a:5'TTTAGCTCTTCTTGTCGCCGTTG 3'。PCR擴增時退火溫度為60℃，延伸30 s，循環(huán)30次，產(chǎn)物長度為426 bp。并以β-actin作為內(nèi)參照，上游引物5'CTGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC3'，下游引物5'TGCCACAGGATTCCATACCCAAG3'，PCR擴增時退火溫度為62℃，延伸10 s，循環(huán)30次，產(chǎn)物大小為210 bp。PCR后取5 μl反應液進行電泳并觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建表達載體pcDNA3.1-D4 將純化的重組質(zhì)粒pMD18T-D4利用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切回收后，D4基因大小約為1 600 bp，連接到同樣用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切的pcDNA3.1(-)載體，經(jīng)過篩選和酶切鑒定獲得一個陽性克隆，雙酶切小片段為1 600 bp，與連接前一致，經(jīng)過測序鑒定目的基因沒有發(fā)生突變。見圖1。

圖1 pcDNA3.1-D4表達載體的構(gòu)建

圖2 D4基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染整合及RT-PCR結(jié)果

2.2 D4基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細胞后整合情況及其表達 圖2可見，將線性化的約4 800 bp的基因片段用LipofectamineTM2000穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細胞，用900 μg/ml的G418篩選10～15 d后，用半量篩選濃度維持，篩選得到pcDNA3.1-D4-CHO細胞株，收集細胞提取基因組DNA鑒定D4基因整合情況，D4基因穩(wěn)定整合到CHO細胞的基因組中，與pcDNA3.1-D4質(zhì)粒陽性對照相比，整合進CHO細胞基因組的D4基因的量比較多。進一步收集細胞，提取總RNA做RT-PCR，結(jié)果表明D4基因整合到CHO細胞后，能夠?qū)崿F(xiàn)超表達，成功實現(xiàn)了原生動物基因在哺乳動物細胞中的過表達。β-actin內(nèi)參的表達情況進一步證實了D4基因在CHO細胞中的高表達。

3 討論

將經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的原生動物D4基因進行人工合成，并連接到哺乳動物表達載體pcDNA3.1(-)之后獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1-D4。本實驗如預期實現(xiàn)了D4基因在RNA水平的表達。此外，通過瞬時轉(zhuǎn)染CHO細胞，能夠高效發(fā)揮△4去飽和酶活性，將DPA轉(zhuǎn)化成DHA，表明該基因能夠在哺乳動物細胞內(nèi)實現(xiàn)蛋白水平的表達并發(fā)揮功能，補充了哺乳動物原來缺乏的△4去飽和酶活性。但是要從其他低碳鏈不飽和脂肪酸生成高含量的DHA，還需要其他延長酶類和去飽和酶類的協(xié)同作用。DHA的生物合成途徑及其機制尚不完全清楚。目前有兩種觀點，一種認為在EPA(20∶5n-3)合成后進行2個碳的延長生成DPA(22∶5n-3)，再經(jīng)過△4去飽和酶作用產(chǎn)生DHA(22∶6n-3)。但哺乳動物中一直未發(fā)現(xiàn)△4去飽和酶活性，因此，該觀點未獲得廣泛認可。另一種觀點是認為EPA(20∶5n-3)延伸為DHA(22∶5n-3)繼續(xù)延伸為24∶5n-3，然后迅速被△6去飽和酶作用生成24∶6n-3，之后進一步經(jīng)β-氧化作用產(chǎn)生22∶6n-3，即所謂的Sprecher通路〔5，6〕。本研究將原生動物 D4基因轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞中，實現(xiàn)了該基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達，為進一步研究其在哺乳動物中合成DHA的功能打下基礎。在哺乳動物細胞構(gòu)建EPA-DPA-DHA的合成路徑，從而提高DHA在哺乳動物細胞中的合成量。

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2 Duda MK，O'Shea KM，Stanley WC.Omega-3 polyunsaturated fatty acid supplementation for the treatment of heart failure:mechanisms and clinical potential〔J〕.Cardiovasc Res，2009;84(1):33-41.

3 Fetterman Jr JW，Zdanowicz MM.Therapeutic potential of n-3 polyunsaturated fatty acids in disease〔J〕.Am J Health Syst Pharm，2009;66(13):1169-79.

4 Meyer A，Cirpus P，Ott C，et al.Biosynthesis of docosahexaenoic acid in Euglena gracilis:biochemical and molecular evidence for the involvement of a Delta4-fatty acyl group desaturase〔J〕.Biochemistry，2003;42(32):9779-88.

5 Huang YS，Pereira SL，Leonard AE.Enzymes for transgenic biosynthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids〔J〕.Biochimie，2004;86(11):793-8.

6 Zhang L，Ramtohul Y，Gagné S，et al.A multiplexed cell assay in hepG2 cells for the identification of Delta-5，Delta-6，and Delta-9 desaturase and Elongase inhibitors〔J〕.J Biomol Screen，2010;15(2):169-76.