張 美 萍，葉 淑 紅，王 際 輝，王 晗，肖 珊，金 慧 燕

(大連工業(yè)大學(xué) 遼寧省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116034)

0 引 言

苦瓜具有提高人體免疫力等良好的食用和藥用價(jià)值[1]，但苦瓜籽目前還未能引起人們的關(guān)注和重視，常常作為廢物棄掉。近期的研究表明，苦瓜籽中同樣含有豐富的活性成分[1]。苦瓜籽蛋白可以特異性地抑制一些腫瘤細(xì)胞，誘發(fā)其凋亡，但對正常的細(xì)胞卻沒有毒副作用，因此在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用上有著廣闊的前景[2]。

近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者從苦瓜籽中提取蛋白質(zhì)并對其生理作用進(jìn)行研究[3－4]，研究發(fā)現(xiàn)，苦瓜籽蛋白具有多方面的生物活性和功能，尤其在清除自由基方面。目前對于苦瓜籽蛋白的抗氧化活性主要是研究SOD(超氧化物歧化酶)的活性[5]，而清除羥自由基(·OH)的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)優(yōu)化了苦瓜籽蛋白的提取條件，并研究了苦瓜籽蛋白的還原力和清除羥自由基(·OH)的能力，為以后進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

干苦瓜籽，山東壽光市場中購買。

考馬斯亮藍(lán)G－250(0.1mg／mL)：稱取50mg G－250溶于25mL 95%乙醇中，加入50mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至500mL。標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白液(1.0mg／mL)：稱取100mg牛血清蛋白，用0.9%生理鹽水配制，定容至100mL。鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸二氫鉀、番紅花紅、ED－TA－Na2、硫酸亞鐵、硼酸、甲基紅、無水乙醇、溴甲酚綠等，分析純；85%濃磷酸、丙酮等。

1.2 方 法

1.2.1 苦瓜籽粉的制備

將曬干的苦瓜籽去殼粉碎，過50目篩，得苦瓜籽粉，105℃恒重法[6]測定苦瓜籽中的水分。

1.2.2 苦瓜籽蛋白的提取

準(zhǔn)確稱取2.0g苦瓜籽粉，加入2mmol／L不同pH的磷酸緩沖液(PBS)20mL，于25℃、150r／min條件下攪拌一定時(shí)間后于10 000r／min離心15min，離心后取上清液，加入一定液料比的50%的丙酮溶液，搖勻。將混合溶液于4 000r／min離心10min，取沉淀，加入2mmol／L的磷酸緩沖液(PBS)(pH＝7.2)10mL溶解，得到的溶液為苦瓜籽蛋白的粗提液[7]。

1.2.3 成分測定方法

粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用凱氏定氮法[8]，提取液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[9]，粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用索氏提取法[10]。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

分別以液料比、提取體系pH、攪拌時(shí)間為單因素，考察各因素對苦瓜籽蛋白提取率的影響。各因素水平梯度分別為：液料比1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1；提取體系pH 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0；攪拌時(shí)間 1、2、3、4、5h。將提取液中蛋白質(zhì)和苦瓜籽總蛋白質(zhì)量之比定義為蛋白質(zhì)提取率(%)。

1.2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)平行，采用L9(33)試驗(yàn)。其因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and levels

1.2.6 苦瓜籽蛋白還原能力的測定

取不同濃度的苦瓜籽蛋白樣品溶液1mL，加入0.2mol／L的pH 6.6磷酸緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5mL，混勻，50℃水浴保溫20min，冷卻，加入2.5mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)。搖勻，離心，取上清液2.5mL，加入2.5mL去離子水和0.5mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻，靜置10min，以去離子水作參比，700nm下測定吸光度值。以同濃度維生素C作陽性對照，吸光度值越大表示還原能力越強(qiáng)[12]。

1.2.7 苦瓜籽蛋白對羥自由基的清除

取0.15mol／L pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液1.0mL、番紅花紅(0.52mg／mL)0.2mL、6mmol／L的 EDTA－Na2－Fe2＋1.0mL(現(xiàn) 配 現(xiàn)用)，再加入不同濃度的樣品溶液3mL，最后加入0.3%的過氧化氫0.8mL，混勻后于37℃水浴中保溫30min，在520nm處測定吸光值，空白組以等體積去離子水代替樣品溶液，對照組以等體積去離子水代替樣品溶液和過氧化氫溶液。以同濃度維生素C代替多糖作對比試驗(yàn)[13]。結(jié)果按下式計(jì)算：

式中：A0為空白組吸光度值；A1為苦瓜籽蛋白樣品的吸光度值；A2為對照組吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 苦瓜籽粗蛋白的含量

用恒重法測得苦瓜籽粉含水分為4.0%。用凱氏定氮法測得的苦瓜籽蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.6%，與文獻(xiàn)報(bào)道的39%～45%一致[14]。用索氏提取法測得苦瓜籽脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38%。表明苦瓜籽具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 液料比的影響

由圖1可知，苦瓜籽蛋白質(zhì)提取率受液料(丙酮與樣液)比的影響較明顯，隨著丙酮體積增大，苦瓜籽蛋白質(zhì)提取率隨之上升，當(dāng)液料比為3.5∶1時(shí)達(dá)到最大值16.28%，液料比為4∶1時(shí)蛋白質(zhì)提取率開始降低?？赡苁潜獫舛忍邔?dǎo)致蛋白質(zhì)變性使可溶性蛋白溶解度降低，從而使蛋白質(zhì)提取率降低，所以液料比選擇3.5∶1為最佳。

圖1 液料比對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of liquid－solid ratio on the protein extraction rate

2.2.2 提取體系pH的影響

由于蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，所以提取體系的pH會影響苦瓜籽蛋白的提取率。比色法測得該苦瓜籽蛋白的等電點(diǎn)為3.0～5.0，所以pH在2.0～6.0，蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀使得可溶性蛋白含量降低，造成蛋白質(zhì)提取率較低。由圖2可知，當(dāng)pH為10.0時(shí)，苦瓜籽蛋白的提取率達(dá)到最大18.98%。這可能是由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近溶解度最小，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，溶解度增加，提取率增加；但pH為12.0時(shí)，可能蛋白質(zhì)因變性而沉淀，提取率降低。所以當(dāng)提取體系pH為10.0時(shí)，提取率達(dá)到最大。

圖2 pH對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of pH on the protein extraction rate

2.2.3 攪拌時(shí)間的影響

由圖3可知，隨著攪拌時(shí)間的延長，苦瓜籽蛋白質(zhì)提取率增大，4h后開始逐漸下降。這是由于隨著攪拌時(shí)間的延長，溶液中的蛋白質(zhì)出現(xiàn)凝聚而沉淀，離心后蛋白沉淀被去除，使蛋白質(zhì)提取率降低[15]。當(dāng)攪拌時(shí)間為4h時(shí)提取率最大，最大值為19.13%，因此最佳攪拌時(shí)間為4h。

圖3 攪拌時(shí)間對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of stirring time on the protein extraction rate

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，由表2可以看出，3個(gè)因素對試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序?yàn)椋篈＞B＞C[16]，最佳提取組合為A2B1C3，即液料比為3.5∶1、pH為8.0、攪拌時(shí)間為5h。在此最佳提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，苦瓜籽蛋白的提取率可達(dá)19.43%，根據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道，該提取率處于較高水平。

表2 L9(33)正交試驗(yàn)表Tab.2 Orthogonal table

2.4 苦瓜籽蛋白的抗氧化性

2.4.1 苦瓜籽蛋白的還原能力

物質(zhì)的還原能力與其抗氧化活性之間存在顯著的相關(guān)性[17]。選用不同濃度的苦瓜籽蛋白樣品，測定還原能力和濃度的關(guān)系，與維生素C作對比，結(jié)果如圖4所示。

從圖4中可以看出，苦瓜籽蛋白的還原能力雖然低于維生素C，但是也表現(xiàn)出了一定的還原能力，且其還原能力隨蛋白質(zhì)量濃度的增加而增大?？喙献训鞍椎倪€原能力為其抗氧化活性奠定了基礎(chǔ)。

2.4.2 苦瓜籽蛋白對羥自由基(·OH)清除作用

羥自由基使番紅花紅褪色，因而根據(jù)褪色的程度來衡量·OH的清除效果[15]。選用不同質(zhì)量濃度的苦瓜籽蛋白樣品和維生素C，測定清除羥自由基的清除率和質(zhì)量濃度的關(guān)系，IC50表示當(dāng)清除率達(dá)到50%所需的樣品質(zhì)量濃度，結(jié)果如表3所示。

表3 苦瓜籽蛋白和維生素C對羥自由基(·OH)的清除率Tab.3 The elimination rate of the protein to·OH

由表3可知，苦瓜籽蛋白清除·OH的能力隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加而增大，并且存在著一定的量效關(guān)系。當(dāng)清除率達(dá)到50%時(shí)，所需的苦瓜籽蛋白和VC質(zhì)量濃度分別為0.048 1和0.051 3mg／mL。從表3中可以看出，苦瓜籽蛋白樣品具有較強(qiáng)的清除羥自由基的能力，其清除羥基自由基的能力與同等質(zhì)量濃度的VC接近，最高可達(dá)91.7%，具有較強(qiáng)的清除羥自由基(·OH)的能力。

3 結(jié) 論

以苦瓜籽為原料，對苦瓜籽蛋白的提取方法、抗氧化性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，苦瓜籽中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.6%；單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，液料比為3.5∶1時(shí)，蛋白質(zhì)提取率為16.28%；pH為10.0時(shí)，蛋白質(zhì)提取率為18.98%；攪拌時(shí)間為4h時(shí)，蛋白質(zhì)提取率為19.13%。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取條件為液料比3.5∶1、pH＝8、攪拌時(shí)間為5h，苦瓜籽蛋白的提取率可達(dá)19.43%。抗氧化性的結(jié)果表明，苦瓜籽蛋白具有一定的還原力，其還原力隨著質(zhì)量濃度的增加而增大；苦瓜籽蛋白清除·OH的能力隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加而增大，其清除羥基自由基的能力與同等質(zhì)量濃度的VC接近。

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