李 文， 李民贊， 孫 明

(1.北京工商大學(xué)計算機與信息工程學(xué)院，北京 100048;

2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代精細農(nóng)業(yè)系統(tǒng)集成研究教育部重點實驗室，北京 100083)

菠菜中樂果農(nóng)藥殘留的比色法測定條件研究

李 文1， 李民贊2， 孫 明2

(1.北京工商大學(xué)計算機與信息工程學(xué)院，北京 100048;

2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代精細農(nóng)業(yè)系統(tǒng)集成研究教育部重點實驗室，北京 100083)

為研究菠菜中樂果農(nóng)藥殘留的快速安全檢測方法，根據(jù)樂果在堿性(NaOH)溶液中分解，生成物Na2S和亞硝酰鐵氰化鈉反應(yīng)生成洋紅色產(chǎn)物的原理，對比色條件進行了研究和優(yōu)化.詳細分析并驗證了顯色體系的配制方法，確定了顯色體系的較佳參數(shù)值:pH值為5.7，溫度為24℃，反應(yīng)時間為20 s.實驗結(jié)果表明，最佳比色條件下在390 nm處有明顯的特征吸收峰，可以測定1×10－6的樂果農(nóng)藥殘留.用最小二乘法建立了菠菜中樂果農(nóng)藥殘留的數(shù)學(xué)模型，相關(guān)系數(shù)R2=0.941 5，樣品回收率為91.6%～108.9%，為以后開發(fā)便攜式農(nóng)藥殘留檢測儀器的光源提供了依據(jù).

樂果農(nóng)藥殘留;比色法;光譜分析

樂果屬于我國常用的有機磷農(nóng)藥之一，除作為內(nèi)吸劑外，也有較強的觸殺作用，常用于防治蔬菜、果樹、茶、桑、糧食作物的多種害蟲和葉螨.殘留在水果和蔬菜上的有機磷或環(huán)境中的有機磷進入到有機體內(nèi)，大部分會對生物體內(nèi)膽堿酯酶有抑制作用，使其失去分解乙酰膽堿的能力，造成乙酰膽堿積累，引起神經(jīng)功能紊亂，從而導(dǎo)致肌體的損害［1－3］.現(xiàn)在對果蔬中有機磷農(nóng)藥殘留檢測比較成熟的方法有波譜法、色譜法、色質(zhì)聯(lián)用法等，這些檢測方法步驟復(fù)雜，所用時間長，且儀器昂貴，難以普及［4－7］.酶抑制法、免疫分析法、光譜技術(shù)、生物傳感器技術(shù)和生物芯片技術(shù)等快速檢測技術(shù)也都有其不足之處［8－19］.試劑比色法(簡稱比色法)是通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的一種常規(guī)檢測方法，單獨使用比色法只能檢測微量元素［20］，無法滿足 GB2763—2005規(guī)定的樂果在葉菜中的最大殘留限量1×10－6.本文把傳統(tǒng)的試劑比色法和光譜分析技術(shù)相結(jié)合，由于樂果可以和幾種試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，從安全、經(jīng)濟的角度考慮，選用亞硝酰鐵氰化鈉作為顯色劑，利用分光光度計測定顯色反應(yīng)后溶液的吸光度，滿足了檢測要求.但是亞硝酰鐵氰化鈉的水溶液不穩(wěn)定，顯色試劑的配制和顯色反應(yīng)的效果受到較多因素的影響，吸光度曲線受干擾較大.本文分析并確立了亞硝酰鐵氰化鈉溶液的較佳配制方法和條件，明確了樂果農(nóng)藥的殘留濃度和光譜的吸光度值成正相關(guān)的線性關(guān)系.利用最小二乘法建立了該種農(nóng)藥的含量標準模型，為進一步開發(fā)便攜式在線檢測儀器的光源提供了可行的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 比色試劑的選用

樂果(Rogor)分子式為 C5H12NO3PS2，化學(xué)名O，O-二甲基-S-(N-甲基氨基甲酰甲基)二硫代磷酸酯.和樂果可以發(fā)生顯色反應(yīng)的試劑有多種，如樂果溶液和硝酸銀可生成黃色沉淀物;樂果水解時釋放出甲胺，甲胺和2，4-二硝基氯苯反應(yīng)可生成黃色產(chǎn)物;由于樂果中含有硫，可以和氯化鈀反應(yīng)得到黃色產(chǎn)物;樂果在酸性溶液中較穩(wěn)定，在堿性溶液中迅速水解成硫代磷酸和硫醇，硫化物和亞硝酰鐵氰化鈉反應(yīng)生成洋紅色化合物等.考慮到比色試劑的安全性和經(jīng)濟性，本研究選用亞硝酰鐵氰化鈉作為比色試劑，亞硝酰鐵氰化鈉分子式為Na2［Fe(CN)5NO］，易溶于水，微溶于醇，低毒，價格低廉，易于購買和儲存.樂果在NaOH溶液中分解出Na2S，Na2S和亞硝酰鐵氰化鈉的化學(xué)反應(yīng)式為:

其生成物為洋紅色.

1.2 材料與試劑

40%的樂果乳油農(nóng)藥，北京嘉禾種業(yè)有限公司;去離子水、質(zhì)量濃度為600 g/L的NaOH溶液、亞硝酰鐵氰化鈉晶體、乙醇(分析純)，北京藍弋化工公司.用去離子水分別配置 1 ×10－6，2 ×10－6，4 ×10－6，8 ×10－6，16 ×10－6的樂果溶液.每種溶液取10 mL，分別滴入質(zhì)量濃度為600 g/L的NaOH溶液0.5 mL進行分解.由于亞硝酰鐵氰化鈉的水溶液不穩(wěn)定，分解之后由褐色變?yōu)樗{色，所以該試劑需要臨時配置.取0.5 g亞硝酰鐵氰化鈉溶于50 mL去離子水中，搖勻后取2 mL亞硝酰鐵氰化鈉溶液和上述樂果NaOH溶液混合，在反應(yīng)溫度約為24℃的情況下放置20 s，即刻放入比色皿中用分光光度計進行吸光度測試.對每一濃度在300～900 nm波段分別采集顯色反應(yīng)前和顯色反應(yīng)后的吸光度譜圖.

1.3 實驗儀器及分析軟件

UV－2450型紫外/可見/分光光度計，日本島津集團，分辨率0.1 nm，可用于各種有機、無機固體或液體的光學(xué)特性.該儀器具有測量速度快、測量結(jié)果準確等特點，選定測量波長范圍300～900 nm.采集的數(shù)據(jù)上傳至計算機，利用軟件UVPRO進行光譜預(yù)處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗結(jié)果

不同濃度的樂果農(nóng)藥沒有加入NaOH溶液和亞硝酰鐵氰化鈉的光譜圖見圖1.可以看出，光譜的吸光度值和農(nóng)藥濃度沒有明顯關(guān)系.反應(yīng)溫度24℃，顯色反應(yīng)20 s的條件下不同濃度樂果在顯色反應(yīng)預(yù)處理后的光譜圖見圖2，可以看出其光譜的走勢相同，吸光度值和農(nóng)藥的濃度成正相關(guān)的關(guān)系，即可以利用吸收光譜的吸光度值反映樂果農(nóng)藥的濃度，且在390 nm處有最大吸收峰，根據(jù)比色測定原理，確定敏感波長為λmax=390 nm.

圖1 不同濃度樂果農(nóng)藥未發(fā)生顯色反應(yīng)的吸光度譜圖Fig.1 Absorbance of different concentration rigor pesticide without coloring reaction

圖2 不同濃度樂果農(nóng)藥和亞硝酰鐵氰化鈉發(fā)生顯色反應(yīng)后的吸光度譜圖Fig.2 Absorbance of different concentration rigor pesticide after coloring reaction

2.2 顯色體系中pH值的確定

實驗證明，顯色反應(yīng)的效果對獲取光譜的吸光度值梯度影響很大.顯色反應(yīng)的效果和反應(yīng)時間、溫度、加入NaOH溶液的量以及加入的亞硝酰鐵氰化鈉的量有很大關(guān)系.加NaOH溶液過多時，過量的NaOH和亞硝酰鐵氰化鈉反應(yīng)，生成黃色化合物;加NaOH太少時，生成的Na2S太少，Na2S和亞硝酰鐵氰化鈉反應(yīng)不明顯，因此對不同含量的樂果溶液，如何保證加入適量的NaOH非常必要.由于實際檢測時不知道菠菜中所含樂果的殘留量，無法根據(jù)化學(xué)方程式進行理論計算，實驗中發(fā)現(xiàn)，利用pH計實時測試反應(yīng)溶液的pH值是一個好的方法.在保證溫度和反應(yīng)時間都一樣的情況下，對上述5個濃度的樂果溶液分別依次改變滴入NaOH溶液的量，同時測定溶液中的pH值和390 nm處的吸光度，發(fā)現(xiàn)pH值接近于5.7時吸光度最大，分析認為當樂果和NaOH恰好完全反應(yīng)時，因溶液中有含羥基的化合物，呈酸性，與實驗測試相符.

2.3 顯色反應(yīng)的時間和溫度的確定

實驗發(fā)現(xiàn)，顯色反應(yīng)時間過長或溫度過高時，溶液呈藍色或藍綠色，不能得到洋紅色化合物;時間過短或溫度過低，反應(yīng)不完全，洋紅色現(xiàn)象不明顯.對16×10－6的樂果顯色反應(yīng)預(yù)處理后，在溫度范圍16～46℃(每隔1℃測試一次)，對每一個溫度下的溶液在10～120 s內(nèi)(每隔5 s測試一次)進行390 nm處吸光度的測試.測試結(jié)果顯示，在溫度為23～25℃、時間為20～25 s時，吸光度A的值最大，約為0.59.同時發(fā)現(xiàn)在保持溫度不變時，吸光度隨著反應(yīng)時間的不同有所變動，在反應(yīng)時間一定的情況下，吸光度隨著溫度的改變也有所變化，見圖3.圖3(a)為在溫度保持24℃時放置時間和吸光度A的關(guān)系.圖3(b)為反應(yīng)時間為20 s時溫度和吸光度A的關(guān)系.

圖3 溫度和時間對顯色反應(yīng)后溶液吸光度的影響Fig.3 Effects of temperature and time on solution absorbance after coloring reaction

對其他濃度(1 × 10－6，2 × 10－6，4 × 10－6，8 ×10－6)的樂果溶液進行顯色反應(yīng)預(yù)處理后做同樣的實驗，最佳溫度和時間變化不大，所以將該顯色反應(yīng)的較佳時間確定為20 s，較佳溫度為24℃.

2.4 其他因素的影響

實驗中發(fā)現(xiàn)，由于亞硝酰鐵氰化鈉二水化合物是鮮紅色透明晶體，其水溶液不穩(wěn)定，一定時間后由褐色變成藍色，對顯色反應(yīng)有顏色上的干擾，但是臨時配置亞硝酰鐵氰化鈉溶液，在反應(yīng)時間為20 s時，這一因素的影響可以不計.實驗證明用1.2所述配置方案，所用亞硝酰鐵氰化鈉的量對(0～16)×10－6的樂果的顯色效果沒有明顯差異，且效果較好.若加入的亞硝酰鐵氰化鈉的量比其少時，會反應(yīng)不完全;加入的量過多又會使正常色澤受影響，在390 nm處的吸光度值都會降低.實驗還發(fā)現(xiàn)，若用乙醇配置一定濃度的樂果溶液時，較多的乙醇存在對顯色反應(yīng)也有干擾，使其吸光度降低，因此實驗中用去離子水對樂果進行濃度配置.

2.5 光譜預(yù)處理

利用軟件UVPRO可對原始譜圖有效消除因系統(tǒng)誤差和隨機誤差引起的光譜測量數(shù)據(jù)的噪聲，可能存在各隨機因素引起的光譜信號基線漂移和基線旋轉(zhuǎn).為了從復(fù)雜、重疊、變動的背景中提取光譜有用信號，獲取高信噪比、低背景干擾的分析信號，研究分別采用了基線校正、平滑和數(shù)據(jù)標準化等預(yù)處理方法對所得到的光譜數(shù)據(jù)進行必要的預(yù)處理.

2.6 最小二乘法建立數(shù)學(xué)模型

在λmax=390 nm處利用最小二乘法建立一元回歸模型，相關(guān)系數(shù)R2=0.941 5，具有較好的線性關(guān)系，如圖4.可以看出，在樂果濃度較高時，線性相關(guān)性較好，在樂果濃度低時，線性相關(guān)性較差.

3 實驗驗證

配置濃度為 16 × 10－6，8 × 10－6，4 × 10－6，2 ×10－6及1×10－6的樂果溶液各1組，每組取10 mL均勻噴灑在5顆無公害菠菜葉子上，晾干待用.取5組噴灑有不同濃度毒死蜱溶液的油菜樣品各10 g，將其切碎并和乙醇混合并超聲攪拌60 min，取上清液，并用過濾紙過濾.提取和過濾兩次，過濾液用10 mL乙醇漂洗，濃縮、干燥后，用蒸餾水溶解并定容到5 mL.對5組樣品分別按照1.2的步驟進行預(yù)處理后，測試其吸光度，每個樣品重復(fù)測量3次，取平均值作為分析用數(shù)據(jù).樣品的加標回收率分析結(jié)果如表1(其中加標回收率是指在空白的樣品無公害菠菜中加入定量的檢測物質(zhì)樂果，然后用檢測量除以添加量.n是重復(fù)的次數(shù)).結(jié)果表明，樂果農(nóng)藥的加入量和回收量基本相符，回收率為91.6% ～108.9%.

表1 無公害菠菜的樣品回收率Tab.1 Sample recovery percent of pollution-free spinach

4 結(jié)論

本文從安全經(jīng)濟的角度出發(fā)，選用亞硝酰鐵氰化鈉作為顯色劑，但是其顯色體系的影響因素較多，除了反應(yīng)時間和溫度外，樂果、NaOH及亞硝酰鐵氰化鈉3種反應(yīng)物的量也很關(guān)鍵.通過大量實驗確定了顯色試劑的配置方法，明確了顯色體系的較佳pH值、反應(yīng)時間和溫度.按照上述配置方法獲得的吸光度譜圖在390 nm處可以測定1×10－6的樂果濃度，為探索快速、安全地檢測樂果農(nóng)藥殘留方法提供了有益的參考.但是從一元回歸線性模型可以看出，在樂果濃度較低時，其線性相關(guān)性較差，分析為實驗條件所限引起的誤差，可以繼續(xù)改進試驗方法，提高其線性相關(guān)度.

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Study on Colorimetry Determination Conditions of Rogor Pesticide Residues in Spinage

LI Wen1， LI Min-zan2， SUN Ming2
(1.College of Computer Science and Information Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing100048，China;2.Key Laboratory of Modern Precision Agriculture System Integration Research of Ministry of Education，China Agricultural University，Beijing100083，China)

In order to research the fast and safe determination method of Rogor pesticide residues in spinage，the colorimetric reaction conditions were researched and optimized in this study according to the principle that Nitrosyl iron sodium cyanide can produce carmine product by reacting with Na2S produced from the reaction between Rogor and NaOH solution.The experiment results showed that under the optimum coloring conditions 1 ×10－6Rogor pesticide could be detected at 390 nm absorption wavelength.The configuration method of the colorimetric system was analyzed and the optimum conditions were pH 5.7，suitable coloration temperature 24℃，and reaction time 20 s.The mathematical model was built by the least square method.The correlation coefficient was 0.941 5 and the sample recovery percent was 91.6% ～108.9%，which provide the feasible basis for developing light source of portable pesticide residues detecting instrument.

Rogor pesticide residues;colorimetry;spectrum analysis

TS255;TS207.5

A

2095-6002(2013)06-0058-05

李文，李民贊，孫明.菠菜中樂果農(nóng)藥殘留的比色法測定條件研究.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2013，31(6):58－62.

LI Wen，LI Min-zan，SUN Ming.Study on Colorimetry Determination Conditions of Rogor Pesticide Residues in Spinage.Journal of Food Science and Technology，2013，31(6):58 －62.

2013-01-21

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項資助項目(201003008).

李 文，女，副教授，碩士，主要從事光譜技術(shù)檢測和食品安全性方面的研究.

(責(zé)任編輯:檀彩蓮)