李 浩， 張多斌， 吳 嵐， 馮華坤

研究表明，腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK信號(hào)通路激活，參與了腦缺血神經(jīng)元死亡過(guò)程的調(diào)控［1］。腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixme talloproteinase，MMP-9)與缺血后血腦屏障損傷密切相關(guān)［2］。丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA，TanⅡA)為丹參酮中含量最高的活性成分，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，TanⅡA對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制炎癥和凋亡基因蛋白表達(dá)有關(guān)［3～7］，但是否對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和血腦屏障有影響?本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，研究TanⅡA對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷磷酸化p38MAPK和MMP-9表達(dá)的影響及對(duì)細(xì)胞凋亡的作用，進(jìn)一步探討其保護(hù)作用的可能分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 雄性SD大鼠，清潔級(jí)，質(zhì)量300±20g，桂林醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)分成Sham組、IR組、TanⅡA高、低劑量治療組，每組15只。

1.1.2 藥品和試劑 TanⅡA(陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司提供，純度98%);2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(Sigma公司);兔抗MMP-9抗體，兔抗p38多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒、T UNEL試劑盒和DAB顯色試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 給藥途徑與藥量 TanⅡA低劑量治療組(15mg/kg)和高劑量治療組(30mg/kg)均于術(shù)前連續(xù)灌胃給藥3d，每天1次;假手術(shù)組和缺血再灌注組給予等量的生理鹽水灌胃。3d給藥后1h建立局灶性腦缺血120min再灌注24h動(dòng)物模型。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立及評(píng)分 參照Longa等［8］的方法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。采用頸外動(dòng)脈插入線(xiàn)栓法，各組均進(jìn)行左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞，線(xiàn)栓采用石蠟線(xiàn)栓。線(xiàn)栓直徑約0.27mm，插入深度約18mm，此時(shí)線(xiàn)栓頭位于大腦中動(dòng)脈起始部。缺血90min時(shí)，抽提線(xiàn)栓實(shí)現(xiàn)再灌注。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分:按照Longa等［8］評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，各組分別在再灌注24h進(jìn)行評(píng)分。0分:正常，無(wú)神經(jīng)學(xué)征象;1分:動(dòng)物不能完全神展右前肢;2分:動(dòng)物右側(cè)肢體癱瘓，行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，出現(xiàn)追尾現(xiàn)象;3分:動(dòng)物行走向右側(cè)跌倒，或動(dòng)物不能站立或動(dòng)物打滾;4分:無(wú)自發(fā)活動(dòng)，有意識(shí)障礙。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分在1～3分為模型成功。0分和4分為模型不成功予剔除，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)充剔除出組的動(dòng)物，保證每組動(dòng)物數(shù)。

1.2.3 免疫組化檢測(cè) 缺血再灌注后24h，各組隨機(jī)取5只大鼠，生理鹽水和多聚甲醛進(jìn)行心臟灌流固定，斷頭取腦。在左側(cè)大腦半球距離嗅球尖端7～11mm之間冠狀切取約5mm厚腦組織塊，固定、脫水、包埋成臘塊，連續(xù)切片，厚5μm。用SABC法進(jìn)行磷酸化p38MAPK和MMP-9蛋白的免疫組織化學(xué)染色;陰性對(duì)照片用PBS液代替一抗。磷酸化p38MAPK陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞漿呈現(xiàn)棕黃色粒狀或點(diǎn)狀免疫標(biāo)記，MMP-9陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞漿棕黃色淡染。于每個(gè)鼠腦分別取磷酸化p38MAPK和MMP-9切片，每張切片分別隨機(jī)選取左側(cè)大腦半球額頂部皮質(zhì)5個(gè)不重復(fù)高倍鏡視野(×400)，計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，算出平均數(shù)即為每張切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 再灌注24h，各組隨機(jī)取5只大鼠，用生理鹽水和多聚甲醛進(jìn)行心臟灌流固定，斷頭取腦。在左側(cè)大腦半球距離嗅球尖端7～11mm之間冠狀切取約5mm厚腦組織塊，固定、脫水、包埋成臘塊，連續(xù)切片，厚5μm。連取5張，1張作HE染色，其余4張作細(xì)胞凋亡。采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒代表 TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。每張切片分別隨機(jī)選取左側(cè)大腦半球額頂部皮質(zhì)5個(gè)不重復(fù)高倍鏡視野(×400)，計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，算出平均數(shù)即為每張切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)T UNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，以 T UNEL陽(yáng)性率表示細(xì)胞凋亡。

1.2.5 血腦屏障通透性檢測(cè) 參照 Matsuo等［9］的方法，采用EB染料檢測(cè)BBB通透性。再灌注24h，各組隨機(jī)取5只大鼠，經(jīng)股靜脈注射2%EB生理鹽水3ml/kg。2h后，大鼠麻醉，由左心室用生理鹽水灌流至右心耳流出清亮液體，然后斷頭取腦，稱(chēng)濕質(zhì)量后置入裝有0.5ml1mo l/L KOH溶液的離心管中，37℃ 過(guò)夜，然后加入/丙酮。離心15min，重復(fù)3次取上清液，用751型分光光度計(jì)在波長(zhǎng)620nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)EB液的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算腦組織中的EB水平。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.9統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行運(yùn)算，結(jié)果以±s表示，組間差異顯著性檢驗(yàn)采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 TanⅡA A對(duì)磷酸化p38MPAK表達(dá)的影響 見(jiàn)表1。Sham組在缺血側(cè)腦組織切片可見(jiàn)少量磷酸化p38表達(dá)，免疫反應(yīng)產(chǎn)物顆粒分布彌散，胞漿、突觸內(nèi)少量存在(見(jiàn)圖1)。與Sham組比較，IR組磷酸化p38表達(dá)增多，部位主要分布于缺血周邊區(qū)的額頂皮質(zhì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)圖2)。與IR組比較，anⅡA高、低劑量治療組磷酸化p38表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且高TanⅡA組明顯低于低TanⅡA組(P均＜0.05)(見(jiàn)圖3、圖4)。

2.2 TanⅡA對(duì)MMP-9活性的影響 見(jiàn)表1。再灌注24h，Sham組的腦組織皮質(zhì)有少量MMP-9陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞(見(jiàn)圖5)。與 Sham組比較，IR組的MMP-9陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目明顯增加(見(jiàn)圖6)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(P＜0.05)。與 IR組比較，TanⅡA高、低劑量治療組MMP-9陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且高TanⅡA組明顯低于低TanⅡA組(P均＜0.05)(見(jiàn)圖7、圖8)。

2.3 TanⅡA對(duì)神經(jīng)元凋亡的比較 見(jiàn)表2。假手術(shù)組可見(jiàn)到少量凋亡細(xì)胞。IR組凋亡細(xì)胞數(shù)陽(yáng)性率增加，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)圖9)。與IR組比較，TanⅡA高、低劑量治療組凋亡細(xì)胞數(shù)陽(yáng)性率均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且高TanⅡA組明顯低于低TanⅡA 組(P 均 ＜0.05)(見(jiàn)圖10、圖11)。

2.4 TanⅡA對(duì)EB含量的影響 IR組EB含量明顯升高，與假手術(shù)組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與 IR 組比較，TanⅡA 高、低劑量治療組EB含量明顯降低(P＜0.05)，且高TanⅡA組明顯低于低TanⅡA組(P均＜0.05)。

圖1 Sham組可見(jiàn)少量磷酸化p38MAPK表達(dá)

圖2 IR組可見(jiàn)大量的磷酸化p38MAPK表達(dá)

圖3 TanⅡA低劑量組p38MAPK表達(dá)較IR組減少

圖4 TanⅡA高劑量組p38MAPK表達(dá)較低劑量組減少

圖5 Sham組可見(jiàn)少量MMP-9表達(dá)

圖6 IR組MMP-9表達(dá)增加

圖7 TanⅡA低劑量組MMP-9表達(dá)較IR組減少

圖8 TanⅡA高劑量組MMP-9表達(dá)較低劑量組減少

圖9 IR組可見(jiàn)較多凋亡陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)

圖10 TanⅡA低劑量治療組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞較IR組減少

圖11 TanⅡA高劑量治療組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞較低劑量治療組減少(圖片均為SP染色，×400)

表1 TanⅡA對(duì)磷酸化p38MPAK和MMP-9表達(dá)的影響(±s)

表1 TanⅡA對(duì)磷酸化p38MPAK和MMP-9表達(dá)的影響(±s)

與 Sham組比較*P＜0.05;與 IR組比較 △P＜0.05;與TANⅡA低劑量治療組比較▲P＜0.05

組別 n 磷酸化p38MAPK MMP-9 Sham組IR組TanⅡA低劑量組TanⅡA高劑量組5 5 5 5 20.60 ±2.19 99.00 ±11.13*67.27 ±4.13△30.80 ±2.70△▲92.20 ±3.27 144.40 ±14.94*105.13 ±2.32△85.93 ±1.79△▲

表2 TanⅡA對(duì)凋亡細(xì)胞數(shù)和EB含量的影響(±s)

表2 TanⅡA對(duì)凋亡細(xì)胞數(shù)和EB含量的影響(±s)

與 Sham 組比較*P＜0.05;與 IR組比較△P＜0.05;與TANⅡA低劑量治療組比較▲P＜0.05

組別 n 凋亡細(xì)胞數(shù)陽(yáng)性率 EB含量(μg/g)假手術(shù)組IR組TanⅡA低劑量組TanⅡA高劑量組5 5 5 5 3.48 ±1.15 40.31 ±4.35*34.42 ±3.86△20.15 ±2.38△▲56.18 ±2.11 92.17 ±3.55*81.27 ±3.14△72.55 ±1.59△▲

3 討論

P38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)成員之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和調(diào)控，是將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，并調(diào)控其它基因表達(dá)的重要通路之一。近年有研究表明，腦缺血再灌注后P38MAPK顯著升高，給予P38MAPK特異性抑制劑SB203580可以不同程度的減少梗死體積和神經(jīng)元損害，提示P38MAPK通路參與了缺血后繼發(fā)性腦損傷的信號(hào)傳導(dǎo)［10，11］。MMP-9 是一組 Zn2+依賴(lài)的金屬蛋白酶家族，目前認(rèn)為與腦缺血后血腦屏障損傷的關(guān)系最為密切，抑制它的活化可在一定程度上減輕再灌注血腦屏障損傷［12］。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，大鼠腦缺血再灌注24h，腦組織磷酸化的p38MAPK在缺血側(cè)額頂部皮質(zhì)的梗死區(qū)表達(dá)明顯增多，并且該區(qū)域凋亡細(xì)胞明顯增加，表明p38MAPK信號(hào)通路在腦缺血中參與了神經(jīng)元凋亡過(guò)程，這與Sasaki等［13］的研究基本一致。大鼠腦缺血再灌注24h，缺血側(cè)額頂部皮質(zhì)MMP-9表達(dá)明顯增加，并且缺血側(cè)腦組織EB含量亦明顯增加，表明腦缺血再灌注損傷后血腦血腦屏障破壞，與以往研究相符［14］。

TanⅡA為丹參酮中含量最高的活性成分，我們前期研究發(fā)現(xiàn)［3，4］，TanⅡA 能夠顯著減小腦梗死體積具有腦保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，給予不同劑量的TanⅡA治療腦缺血再灌注損傷大鼠，可明顯減少缺血側(cè)磷酸化p38MAPK表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK通過(guò)調(diào)控c-fos或 c-Jun表達(dá)，改變凋亡晚期基因 caspase-3的表達(dá)介導(dǎo)凋亡［15］。因此，我們推測(cè)，TanⅡA抗凋亡作用與抑制再灌注損傷后p38MAPK通路而下調(diào)caspase-3的表達(dá)有關(guān)［3］。

本實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，給予不同劑量的TanⅡA治療腦缺血再灌注損傷大鼠，可明顯減少缺血側(cè)MMP-9的表達(dá)，減少缺血側(cè)腦組織EB含量，表明TanⅡA具有減少再灌注損傷后血腦屏障破壞的作用。近期研究表明，p38MAPK的表達(dá)與MMP-9存在相關(guān)性［16］。p38MAPK通過(guò)影響一氧化氮合酶(NOS)的表達(dá)而調(diào)節(jié)一氧化氮(NO)含量［17］，而NO可以通過(guò)鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶以及cGMP水平對(duì)MMP-9 活 性 起 到 重 要 調(diào) 節(jié) 作 用［18，19］，提 示p38MAPK、NO和MMP-9三者間可能存在序貫的激活關(guān)系。我們前期研究發(fā)現(xiàn)［20］，TanⅡA能明顯抑制NO及NOS的表達(dá)。因此我們推測(cè)，TanⅡA通過(guò)抑制p38MAPK通路，減少NOS的表達(dá)和NO的生成，從而下調(diào)MMP-9的表達(dá)，這可能是其減少血腦屏障破壞的機(jī)制之一。

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