畢愛芬

近幾年，銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥逐年上升，給治療帶來巨大挑戰(zhàn)[1]。由于銅綠假單胞菌產(chǎn)生金屬β-內(nèi)酰胺酶，而使得其對(duì)碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性，金屬β-內(nèi)酰胺酶可水解基本所有的β-內(nèi)酰胺酶類抗生素，加之其耐藥基因編碼區(qū)在整合子內(nèi)，使得耐藥性能在菌株之間廣泛傳播[2]，而IMP與VIM是最常見的金屬β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因，但金屬β-內(nèi)酰胺酶的攜帶率每個(gè)地區(qū)差異很大，因此，本研究收集本院2010-2012年的銅綠假單胞菌，并進(jìn)行金屬β-內(nèi)酰胺酶與耐藥基因檢測，了解目前金屬β-內(nèi)酰胺酶的相關(guān)耐藥以及在銅綠假單胞菌的攜帶率，以便為臨床治療提供有效的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 實(shí)驗(yàn)菌株由廣州市花都區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院2009年10月-2012年6月住院及門診患者標(biāo)本中分離的銅綠假單胞菌共216株。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853與大腸埃希菌ATCC 25922，購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2 儀器與試劑 儀器為法國生物梅里埃公司的VITEK32全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)，M-H瓊脂為廣州環(huán)凱生物有限公司，亞胺培南（IPM，10 μg/片）、頭孢他啶（CAZ，30 μg/片）均購自英國OXl0D公司，EDTA（100raM，10 ul/片），PCR MIX來自廣州東盛生物科技有限公司。引物由上海英駿生物有限公司合成。

1.1.3 引物序列見表1。

引物 序列 PCR產(chǎn)物大小 參考文獻(xiàn)VIM-F GTTTGGTCGCATATCGCAAC 645bp [3]VIM-R CTACTCGGCGACTGAGCGAT IMP-F CGGCCKCAGGAGMGKCTTT 587bp [4]IMP-R AACCAGTTTTGCYTTACYAT Int1-F GGTGTGGCGGGCTTCGTG 457bp [5]Int1-R GCATCCTCGGTTTTCTGG SPM-F GCGTTTTGTTTGTTGCTC 786 bp [3]SPM-R TTGGGGATGTGAGACTAC GIM- F AGAACCTTGACCGAACGCAG 746 bp [3]GIM-R ACTCATGACTCCTCACGAGG

1.2 方法

1.2.1 金屬β-內(nèi)酰胺酶檢測 采用雙紙片協(xié)同法檢測金屬β-內(nèi)酰胺酶，按照紙片擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)操作[6]，以0.5麥?zhǔn)险{(diào)整菌液濃度后，接種于M-H瓊脂平板上，貼上兩張空白紙片，兩者距離大于20 mm，分別加上3 μl的2-巰基乙醇原液與5 μl的EDTA（100 mmol/L），然后在距離20 mm處貼上亞胺培南（10 mg），頭孢他啶（10 mg），經(jīng)過夜35 ℃培養(yǎng)，若空白紙片與任何一個(gè)藥敏紙片的抑菌環(huán)有擴(kuò)大者，則顯示該菌株產(chǎn)金屬酶。

1.2.2 整合子檢測 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA[7]。在培養(yǎng)基上挑取2～3個(gè)菌落于400 μl的TE緩沖液里混勻，然后95 ℃10 min水浴，12 000 r/min離心10 min，取上清液作PCR模板，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照產(chǎn)品說明配制PCR體系，PCR循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃ 5 min。取PCR產(chǎn)物電泳后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.3 耐藥基因檢測 細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取采用SDS堿裂解法，按照產(chǎn)品說明配制PCR體系，PCR循環(huán)參數(shù)為：95 ℃4min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 循環(huán) 30 次；72 ℃8 min。

1.2.4 質(zhì)控 每周按標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格使用 質(zhì) 控 菌銅綠假單胞菌ATCC 27853與大腸埃希菌ATCC 25922對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制。

2 結(jié)果

2.1 菌株基本情況 攜帶金屬β-內(nèi)酰胺酶的菌株共檢測出80株，占37.03%（80/216），來源科室主要是ICU、內(nèi)科及外科，分別是33例（41.25%），18例（22.5%），14例（17.5%），標(biāo)本大部分來自患者痰，占61.25%（49/80），患者男54例，女26例，平均年齡77歲。

2.2 產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶菌株 216株臨床分離株通過雙紙片協(xié)同法檢出80株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶（MBL），其中78.75%（63/80）的MBL菌株都是多藥耐藥菌株，甚至有18.75%（15/80）是泛耐藥株。藥敏試驗(yàn)結(jié)果中，耐藥性最高的前三位是氨曲南，環(huán)丙沙星和哌拉西林，耐藥率都達(dá)77%以上，見表2。

表2 80株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的銅綠假單胞菌耐藥情況

2.3 VIM與IMP基因檢測結(jié)果 對(duì)80株MBL菌株進(jìn)行IMP與VIM基因擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)23株（28.75）攜帶IMP基因，9株（11.25%）被檢測到有攜帶VIM基因，它們的長度分別是587bp與645bp。見圖1、圖2。其中9株攜帶VIM基因的菌株都對(duì)亞胺培南抗生素耐藥，而87.5%的VIM與IMP基因陽性菌株都是多藥耐藥。

2.4 整合子檢測結(jié)果 Ⅰ類整合子檢出率卻達(dá)MBL陽性菌株的82.5%（66/80），電泳圖可見457bp大小目的片段，見圖3。其中亞胺培南耐藥菌株中Ⅰ類整合子陽性率占85.71%（48/56）。未檢出SPM與GIM基因。

圖1 IMP基因電泳圖

圖2 VIM基因電泳圖

圖3 Int1基因電泳圖

3 討論

近幾年，產(chǎn)金屬酶的銅綠假單胞菌備受臨床關(guān)注，正由于金屬酶能水解幾乎所有的β-內(nèi)酰胺酶類抗生素，甚至出現(xiàn)了超級(jí)細(xì)菌攜帶NDM-1基因金屬酶，給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)。本研究結(jié)果表明，產(chǎn)生金屬酶的銅綠假單胞菌對(duì)各類抗生素耐藥率高，達(dá)70%以上，根據(jù)中國CHINET的數(shù)據(jù)，銅綠假單胞菌對(duì)各種抗生素的耐藥率一般都是30%左右[8-9]，而攜帶了金屬酶大大提高了其耐藥率，且出現(xiàn)多藥耐藥株甚至是泛耐藥株。在住院患者中，大部分患者都是內(nèi)科和ICU，占63.5%，國內(nèi)外報(bào)道表明，ICU一直以來都比院內(nèi)其他部門耐藥率要高[10-11]。Lodise等[12]認(rèn)為，由于ICU收治的患者多為重患者，患者免疫功能低下，診療過程中的各種侵襲性操作和大量廣泛使用廣譜抗菌素，致使入住ICU成為多藥耐藥株產(chǎn)生的危險(xiǎn)因素。

檢測金屬酶的方法有許多，入PCR法、E-test法、三位試驗(yàn)、紙片增效法及紙片協(xié)同法，本文利用金屬酶的特征：二價(jià)金屬離子與EDTA等有機(jī)絡(luò)合劑絡(luò)合的關(guān)系，從而觀察抑菌圈增大來判斷細(xì)菌是否產(chǎn)生金屬酶[13]。此方法操作簡單，經(jīng)濟(jì)，快捷，非常適合臨床篩選金屬酶檢測使用，本院分離的銅綠假單胞菌中金屬β-內(nèi)酰胺酶的攜帶水平較高，陳鍵[14]研究表明，銅綠假單胞菌金屬酶的檢出率是27.8%，而本研究達(dá)37.03%，國外銅綠假單胞菌的金屬β-內(nèi)酰胺酶檢出率相對(duì)較低[15]。由此看出，本院應(yīng)加強(qiáng)對(duì)應(yīng)金屬β-內(nèi)酰胺酶方法建立以及管理。

金屬酶又分為先天型和獲得型，銅綠假單胞菌大部分都是獲得型金屬酶，有五種類基因型VIM、IMP、SPM和GIM、SIM，其中最常見的是IMP和VIM。大多數(shù)獲得性金屬酶位于可移動(dòng)的整合子中，少數(shù)通過可移動(dòng)的共同區(qū)域（cR）進(jìn)行轉(zhuǎn)移[16]。本研究中IMP與VIM基因檢出率分別為28.75%（23/80）與11.25%（9/80），其檢出率與國內(nèi)同期文獻(xiàn)檢出率基本一致，可見產(chǎn)金屬酶的銅綠假單胞菌更容易導(dǎo)致IMP耐藥。謝才文[4]與肖震等[17]研究報(bào)道，IMP檢出率是14.7%（28/190），VIM檢出率11.5%（12/104），而整合子檢出率達(dá)金屬酶菌株的82.5%（66/80），這也表明了大多數(shù)獲得性金屬酶都位于整合子中，使得菌株攜帶的耐藥基因更容易在院內(nèi)廣泛傳播，增加了院內(nèi)感染耐藥性菌株機(jī)會(huì)，此外，這次研究中亞胺培南耐藥菌株中Ⅰ整合子陽性率占85.71%（48/56），Shinobu等[18]研究表明，金屬酶在強(qiáng)啟動(dòng)子下表現(xiàn)高活性，從而引起亞胺培南耐藥，這或許能推測出本研究中亞胺培南耐藥與整合子的相關(guān)性由此引起。

由于本院感染的銅綠假單胞菌產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的檢出率較高，且其耐藥率較非產(chǎn)酶的銅綠假單胞菌明顯增高，因此，在臨床用藥治療時(shí)必須依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇敏感的抗生素成為治療關(guān)鍵。院內(nèi)應(yīng)加強(qiáng)銅綠假單胞菌的金屬β內(nèi)酰胺酶的監(jiān)測，同時(shí)了解其科室分布狀況及藥敏情況，分析耐藥趨勢，以便采取適當(dāng)及時(shí)的有效措施控制銅綠假單胞菌院內(nèi)感染廣泛擴(kuò)散，提高治療成功的幾率。

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