胡 靜，侯新遠(yuǎn)，尹紹武，祝 斐，賈一何，胡亞麗

（1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京210023；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，廣東 廣州510300）

波紋唇魚（Cheilinus undulatus）俗名蘇眉，在分類學(xué)上隸屬鱸形目（Perciformes）、隆頭魚科（Labridae）、唇魚屬（Cheilinus），是一種暖水性魚類，同時也是體型最大的珊瑚礁魚類之一。分布于非洲東岸、紅海以及印度洋至太平洋中心，在我國主要分布于南海與東海的南部海域以及臺灣海域［1-3］。波紋唇魚為名貴的海水經(jīng)濟魚類，其肉質(zhì)細(xì)嫩味鮮，營養(yǎng)價值高，深受亞洲人喜愛［4］。因過度捕撈及珊瑚礁棲息地破壞等因素，導(dǎo)致自然海區(qū)的波紋唇魚數(shù)量越來越少，目前已瀕臨滅絕。1996-2005年間波紋唇魚曾4度被世界自然保護聯(lián)盟（IUCN）、世界自然基金會（WWF）等組織和《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》（CITES）列入瀕危物種名單。因此，應(yīng)加大對其野生資源的保護力度，同時加強和加快對其種質(zhì)資源的研究，以期對其進行更加合理的開發(fā)和保護。

目前，國內(nèi)外有關(guān)波紋唇魚的研究報道較少，多集中在該魚生物學(xué)研究方面［5-8］，而國內(nèi)僅見對其消化系統(tǒng)組織學(xué)研究［9］、不同組織同工酶表達(dá)差異研究［10］、核型分析［11］、營養(yǎng)成分分析［12］以及鰓絲結(jié)構(gòu)觀察［13］等方面報道，未見關(guān)于該魚種質(zhì)資源方面的研究。近年來，微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于物種進化、生物群體內(nèi)的遺傳變異、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建以及種間關(guān)系甚至生物個體鑒別等領(lǐng)域［14］。本研究采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)對波紋唇魚4個野生群體進行遺傳多樣性分析，旨在為波紋唇魚這一瀕危物種的保護生物學(xué)和資源開發(fā)提供更多基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

野生波紋唇魚共101尾分別取自海南陵水、馬來西亞、西沙以及南沙群島附近海域，采樣信息見表1。分別取尾鰭固定在95%乙醇中帶回實驗室，更換兩次95%乙醇后置于-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 波紋唇魚樣品的基本信息Table 1 Basic information of Cheilinus undulatus samples

1.2 引物合成

從本實驗室自主開發(fā)的波紋唇魚微衛(wèi)星引物中選取15對，并在5′端按照擴增目的片段大小分別標(biāo)記了3種熒光染料：HEX、FAM及TAMRA，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列信息和退火溫度等見表2。

表2 15對微衛(wèi)星引物信息Table 2 The information of fifteen microsatellite primers

1.3 基因組DNA的提取

對常規(guī)“酚-氯仿”抽提法［15］稍加改動，提取波紋唇魚尾鰭基因組DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，并利用紫外分光光度計檢測其濃度和純度，調(diào)整濃度至50 ng／μL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增與產(chǎn)物檢測

用合成的15對熒光引物對波紋唇魚4個群體進行PCR擴增，反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 2μL，1.5 μL 25 m M MgCl2，2μL 25 m M d NTP，正向引物F和反向引物R各1μL，taq酶0.2μL，DNA 模板為1μL，雙蒸水11.3μL。反應(yīng)程序為：94℃5 min后，94℃30s，退火（溫度見表2）30s，72℃30 s，30個循環(huán)；72℃5 min，4℃保溫。以8%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳結(jié)合銀染法檢測PCR產(chǎn)物，如位點T462的部分PCR擴增產(chǎn)物見圖1，將擴增目的條帶清晰的PCR產(chǎn)物在ABI 3500XL基因分析儀上進行毛細(xì)管電泳，檢測產(chǎn)物片段大小。

圖1 位點T462的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification profile of the primer T462

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用軟件Gene Mapper 4.1分析讀取毛細(xì)血管電泳片段長度后，利用群體遺傳多樣性分析軟件POPGEN32分析計算每個群體及整體水平上的有效等位基因數(shù)（Ne）、平均觀測雜合度（Ho）、平均期望雜合度（He）及Nei's遺傳相似指數(shù)［16］和遺傳距離，并采用UPGMA法構(gòu)建群體間的系統(tǒng)樹；PIC-CALC 0.6計算多態(tài)信息含量（PIC）；最后由遺傳分化分析軟件Areliquin3.1［17］計算出遺傳分化參數(shù)并對群體的遺傳變異進行AMOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1 SSR擴增結(jié)果

本研究所用15對微衛(wèi)星引物在4個波紋唇魚群體中均能穩(wěn)定擴增，等位基因數(shù)為3～16個，平均每對引物產(chǎn)生9個等位基因。其中A3位點在馬來西亞群體中獲得的等位基因數(shù)最少（3個），位點B30（2）在南沙群體中獲得的等位基因數(shù)最多（16個），擴增片段在110～289 bp之間（表3）。

表3 15個微衛(wèi)星位點擴增結(jié)果Table 3 The results of amplification of fifteen microsatellite loci

2.2 群體的遺傳多樣性分析

15對微衛(wèi)星引物在4個波紋唇魚群體中共檢測到246個等位基因，其中陵水群體（LP）131個，馬來西亞群體（MP）140個，西沙群體（XP）114個，南沙群體（NP）160個。分析4個野生波紋唇魚群體的等位基因數(shù)、期望雜合度（He）、觀測雜合度（Ho）、多態(tài)信息含量（PIC）和Shannon's信息指數(shù)結(jié)果（表4）表明，馬來西亞群體的各遺傳多樣性參數(shù)最高，而平均等位基因數(shù)（Na）、平均有效等位基因數(shù)（Ne）、平均多態(tài)信息含量（PIC）和平均Shannon's信息指數(shù)（I）均以西沙群體最低，分別為7.467，3.876，0.669和1.551，平均觀測雜合度（Ho）和平均期望雜合度（He）則以南沙群體最低（0.443和0.712）?？傮w分析發(fā)現(xiàn)，4個波紋唇魚群體的各遺傳變異參數(shù)均較高，PIC均＞0.5，說明這些海域的野生波紋唇魚仍具有較高的遺傳多樣性水平。

表4 4個波紋唇魚群體的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of four C.undulatus groups

2.3 群體間的遺傳距離和聚類分析

基于Nei's遺傳距離構(gòu)建4個波紋唇魚群體的UPGMA系統(tǒng)樹（圖2），結(jié)果顯示陵水群體與馬來西亞群體的親緣關(guān)系最近，首先聚為一支，然后與西沙群體聚在一起，最后再與親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的南沙群體聚在一起。Nei無偏倚遺傳距離范圍為0.145 7～0.226 1，遺傳相似度范圍0.766 7～0.864 4（表5），其中陵水群體與馬來西亞群體的遺傳距離最?。?.145 7），遺傳距離最大的為南沙群體和馬來西亞群體（0.226 1）。

圖2 4個波紋唇魚群體的UPGMA系統(tǒng)樹Fig.2 UPGMA tree of four C.undulatus groups

表5 4個波紋唇魚野生群體的遺傳相似指數(shù)與遺傳距離Table 5 Nei's genetic identity and genetic distance of four C.undulatus groups

2.4 遺傳變異和基因流

用Arlequin3.1軟件對4個波紋唇魚群體進行AMOVA遺傳變異方差分析（表6），結(jié)果表明，波紋唇魚60.90%的遺傳變異來自于個體間，35.75%的遺傳變異來自于群體內(nèi)個體間，僅有4.15%的遺傳變異來自于群體間，說明波紋唇魚的遺傳變異主要來自于群體內(nèi)部，且變異水平較高。由Arlequin3.1軟件生成的群體間的遺傳分化系數(shù)（Fst=0.373 0）［18］及其計算所得基因流數(shù)值（Nm=0.840 5）來看，波紋唇魚群體間存在顯著地基因交流障礙并且群體可能由于遺傳漂變而發(fā)生了分化［19］。

表6 基于微衛(wèi)星分子標(biāo)記的波紋唇魚4個群體AMOVA分析Table 6 The AMOVA analysis of the four C.undulatus populations in microsatellite loci

3 討 論

3.1 波紋唇魚的遺傳多樣性

群體的遺傳多樣性高低是判斷一個生物物種適應(yīng)能力、生存能力和進化潛力的重要依據(jù)。豐富的遺傳多樣性是一個物種具有較強的環(huán)境適應(yīng)能力和較大的生物進化潛力以及豐富的育種和遺傳改良能力的重要特征，并對種質(zhì)鑒定和親本選擇具有重要的意義［20-21］。有效等位基因數(shù)是基因純合度的倒數(shù)，能反映基因座等位基因間的相互作用［22］。平均雜合度、PIC、Shannon's信息指數(shù)也是目前衡量遺傳多樣性的重要指標(biāo)。本研究中，陵水群體、馬來西亞群體、西沙群體和南沙群體的平均有效等位基因分別為4.114，4.887，3.876，4.243；平均觀測雜合度（平均期望雜合度）分別為0.520（0.727），0.531（0.736），0.457（0.724），0.443（0.712）；平均多態(tài)信息含量分別為0.687，0.696，0.669，0.673，均＞0.5；平均Shannon's信息指數(shù)分別為1.620，1.705，1.551，1.675。從上述4個指標(biāo)可以看出，4個不同地理海域的野生波紋唇魚群體均具有豐富的遺傳多態(tài)性，蘊藏著較大的進化潛力，且以馬來西亞群體最高。因此，通過對野生波紋唇魚遺傳多樣性的分析來評價自然災(zāi)害、環(huán)境污染、人為因素等對其種質(zhì)資源所帶來的遺傳學(xué)影響，對尋找科學(xué)合理的開發(fā)保護途徑具有重要的意義。

3.2 波紋唇魚群體間的親緣關(guān)系和遺傳分化

遺傳距離是研究物種遺傳多態(tài)性的基礎(chǔ)，常用來描述品種（系）的遺傳結(jié)構(gòu)、品種間的差異與遺傳關(guān)系［23］。本研究通過4個波紋唇魚群體的遺傳距離研究發(fā)現(xiàn)，海南陵水群體與馬來西亞群體的遺傳距離最?。?.145 7），先聚為一支，然后與西沙群體聚在一起，南沙群體與其它3個群體的遺傳距離較遠(yuǎn)，獨立一支。這種導(dǎo)致遺傳距離遠(yuǎn)近與地理距離不一致現(xiàn)象發(fā)生的原因可能是：1）與南沙海域樣品采集地點偏遠(yuǎn)有關(guān)；2）與本研究所采用的分子標(biāo)記技術(shù)有關(guān)。因此，要闡明遺傳距離與地理距離的確切關(guān)系，還需結(jié)合其它分子標(biāo)記對更多地點的樣本做進一步分析。

Fst作為分化系數(shù)可用于分析群體遺傳結(jié)構(gòu)，Shaklee［24］指出若固定指數(shù)Fst在0～0.05之間，說明群體間的遺傳差異很??；若Fst在0.05～0.15之間，說明群體間存在中等程度的遺傳差異；若Fst在0.15～0.25之間，說明群體間的遺傳差異比較大；若Fst＞0.25，則說明群體間的遺傳差異很大。通過對波紋唇魚群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析（表6）表明，本研究中的4個波紋唇魚群體并不是一個無分化的大群體族群，而是各群體遺傳差異很大（Fst=0.373 0）且遺傳物質(zhì)非均勻分布的族群。其中，60.90%的遺傳變異來自于個體間，35.75%的遺傳變異來自于群體內(nèi)個體間，僅有4.15%的遺傳變異來自于群體間，也充分驗證了這一點。

根據(jù)群體遺傳學(xué)理論，基因流越順暢，遺傳分化的程度將越低［25］。Slatkin［26］和 Hamrick等［27］認(rèn)為，若每代遷入個體數(shù)Nm＞1，基因流就足以抵制遺傳漂變的作用，也同時防止了群體分化的發(fā)生；若Nm＜1，基因流不足以抵制群體內(nèi)因漂變引起的遺傳分化，即有限的基因流可以促使群體發(fā)生遺傳分化。本研究得出波紋唇魚4個野生群體Nm=0.840 5，說明遺傳漂變對波紋唇魚的遺傳結(jié)構(gòu)有重要影響。遺傳漂變會造成一些等位基因的丟失和另一些等位基因的固定，從而引起同一物種對不同環(huán)境的適應(yīng)，再通過生存空間的擴展，形成物種的微進化［28］。因此，遺傳漂變對本研究中波紋唇魚群體遺傳分化的影響不容忽視。當(dāng)然，波紋唇魚這種分化格局的出現(xiàn)還可能與其種群數(shù)量急劇減少、活動范圍相對狹窄、氣候環(huán)境劇變、地質(zhì)結(jié)構(gòu)變化等多種因素有關(guān)，有待進一步考證。

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