王晨楓，左玉柱，裴麗華，楊 震，范京惠

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定071001）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）［1］引起的以嚴(yán)重腹瀉和仔豬高致死率為主要特征的傳染病。該病首次報(bào)道于英國，隨后許多國家相繼報(bào)道［2］，我國于1976年發(fā)現(xiàn)此病［3］。目前該病已成為中國甚至亞洲最常見的豬腹瀉性傳染病之一［4］。因此，PED的防控研究具有重要的意義。PED呈地方流行性，PEDV在流行的過程中為更好地適應(yīng)環(huán)境，會(huì)發(fā)生變異，不同地區(qū)的毒株有顯著差異，地區(qū)相距越遠(yuǎn)、環(huán)境差異越大的地方毒株差異越大。研究發(fā)現(xiàn)，S基因相比較于其他基因更易發(fā)生變異［5－8］，S蛋白是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的主要結(jié)構(gòu)蛋白［9－10］，具有高度免疫原性，此外，感染PEDV豬血清中的抗S蛋白抗體持久，可在長時(shí)間中檢測到S蛋白的抗體。這些特性使其成為豬流行性腹瀉的主要早期診斷蛋白。本研究對PEDV S基因抗原性較高的片段進(jìn)行克隆并測序，利用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)對重組S蛋白進(jìn)行表達(dá)和純化，為建立PEDV的快速、敏感、特異的免疫學(xué)檢測方法提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 豬流行性腹瀉病毒華北撫寧株（HB／FN）由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存；6周齡～8周齡SPF級(jí)Balb／c小鼠購于北京東大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 Trizol為GIBCO公司產(chǎn)品；MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、pMD19－T載體、250bp DNA Marker、DNA Marker DL 5 000等為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒純化試劑盒、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG羊及抗鼠IgG為CWBIO公司產(chǎn)品；E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞和蛋白Marker為TransGen公司產(chǎn)品；蛋白純化試劑盒B－PER（r）6×His Spin Purification kit為PIERCE公司產(chǎn)品；TMB、完全弗氏佐劑（FCA）和不完全弗氏佐劑（FCIA）為SIGMA公司產(chǎn)品；pET－28a（＋）載體、pET－32a（＋）載體、pGEX－6p－1載體、Vero細(xì)胞、E.coli BL21（DE3）以及兔抗PEDV的陽性血清由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank中發(fā)表的PEDV中國LZC株S基因序列（登錄號(hào)EF185992.1），并且根據(jù)pMD 19－T 克隆載體的特點(diǎn)，用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)了一對引物，在上游引物引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 080bp。引物序列為：SP1：5′－ATGTATTCTGTTACGCCATG－3′；SP2：5′－TTATACGGTAAGTTGGGTCA－3′。

1.2.2 S基因的克隆與序列測定 豬流行性腹瀉病毒HB／FN株于Vero細(xì)胞上培養(yǎng)72h，反復(fù)凍融3次。取250μL病毒培養(yǎng)液，加入750μL Trizol抽提RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物與pMD19－T經(jīng)T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取白色菌落，接種于氨芐LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h后用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，對該質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切鑒定和測序。

1.2.3 優(yōu)勢抗原表位的選取和重組表達(dá)載體的構(gòu)建 測序結(jié)束后，將基因序列登陸于GenBank。對擴(kuò)增片段進(jìn)行抗原性分析，選取抗原性較高的一段設(shè)計(jì)對應(yīng)的引物：SP1（Bam2145）5′－GGATCCATGGTTATTTCTAGTTTG －3；SP2（Xol2800）5′－CTCGAGTTAGACTAGATCTGCCA－3，擴(kuò)增得到一段655bp的基因序列，同樣連到pMD19－T載體上，命名為SFN－T。分別將SFN－T和表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收帶有相互匹配黏性末端的SFN和表達(dá)載體，經(jīng)T4DNA連接酶連接，構(gòu)建出重組表達(dá)載體pET－28a（＋）－SFN、pET－32a（＋）－SFN、pGEX－6p－1－SFN。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后，用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行電泳檢測和酶切鑒定。

1.2.4 PEDV S基因的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE分析 將表達(dá)載體空載體菌種分別接于LB培養(yǎng)基中，200r／min振搖培養(yǎng)12h，取500μL菌液轉(zhuǎn)接于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD 600nm值＝0.6～1.0），加入終濃度為1 mmol／L的IPTG，在20℃振搖誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)后0、2、3、4、5h取樣1mL，12 000r／min離心1 min，棄上清。沉淀用50μL PBS重懸后，加入等體積的上樣緩沖液，變性儀變性5min，12 000r／min離心1min取上清進(jìn)行SDS－PAGE電泳。

1.2.5 重組蛋白的純化及 Western blot分析 將在28℃條件下用終濃度為1mmoL IPTG誘導(dǎo)5h后的菌體離心，PBS重懸后進(jìn)行超聲波裂解，分別收集上清沉淀進(jìn)行SDS－PAGE檢測。按PIERCE公司的B－PER（r）6×His spin purification kit蛋白純化試劑盒的純化程序?qū)w蛋白進(jìn)行純化。將純化的蛋白進(jìn)行SDS－PAGE電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白及Marker轉(zhuǎn)印到NC膜，將NC膜放入封閉液中37℃慢搖封閉1h，用PBST洗膜3次，每次10min；加入為1∶100的兔抗PEDV的陽性血清。室溫下輕搖1h，用PBST洗膜3次，每次10min；然后加1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫下輕搖1 h，再用PBST洗滌2次，每次10min；最后置于DAB顯色液中避光顯色15min后用蒸餾水終止反應(yīng)。

1.2.6 ELISA檢測方法的建立 取PEDV HB／FN毒株在Vero細(xì)胞上的培養(yǎng)72h的培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次后，8 000r／min離心15min后沉淀，上清液以20 000r／min超速離心2h，把上清液濃縮，測定蛋白濃度后分裝。按常規(guī)ELISA程序進(jìn)行試驗(yàn)確定最適工作條件。

1.2.7 純化蛋白的免疫原性分析 純化的S蛋白經(jīng)SDS－PAGE和Western blot分析后，使用超微量紫外分光光度計(jì)（Micro－Spectrophotometer）測定蛋白濃度。將純化的S蛋白分別用弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑按1∶1比例混合乳化，接種6周齡～8周齡SPF級(jí)Balb／c小鼠5只，并設(shè)對照組。分別于免疫前、首免后7d、14d、21d和30d時(shí)測定小鼠抗體水平以確定純化蛋白的免疫原性。

接種程序：弗氏完全佐劑首免，以后每隔7d用弗氏不完全佐劑免疫小鼠。

2 結(jié)果

2.1 PEDV S基因的PCR擴(kuò)增及鑒定

以加入限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的SP1／SP2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的DNA于10mg／L瓊脂糖凝膠中電泳觀察結(jié)果，在約1 000 bp處出現(xiàn)一條特異的DNA帶，與預(yù)期擴(kuò)增的S基因大小相符。將此片段用試劑盒回收，回收產(chǎn)物連入pMD19－T，構(gòu)建重組質(zhì)粒。參照pMD19－T載體圖譜，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對重組質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)行雙酶切，出現(xiàn)一條1 080bp左右的目的片段和一條2 692bp左右的pMD19－T載體片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。將陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測序，測序結(jié)果表明，擴(kuò)增基因片段長1 080bp，與GenBank參考株的PEDV S基因進(jìn)行Blast序列比對，同源性一致。將克隆得到的S基因登陸于Gen－Bank，獲得序列號(hào)JQ862712。

2.2 S基因優(yōu)勢抗原表位基因克隆載體的建立與鑒定

對S基因進(jìn)行抗原性分析，選取抗原性較高的655bp基因作為連入表達(dá)載體的目的基因，同樣連到pMD19－T載體上，命名為SFN－T。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對重組質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)行雙酶切，出現(xiàn)一條約655bp的目的條帶和一條約2 692bp的pMD19－T載體片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid by double enzyme digestion

圖2 重組質(zhì)粒SFN－T的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of the plasmid SFN－T by double enzyme digestion

2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

用BamHⅠ、XhoⅠ對重組質(zhì)粒pET－28a（＋）－SFN進(jìn)行雙酶切及PCR鑒定（圖3），分別出現(xiàn)一條5 000bp和650bp左右的條帶，說明目的基因正確插入到表達(dá)載體。將含有陽性重組載體的大腸埃希菌在IPTG誘導(dǎo)下，不同誘導(dǎo)時(shí)間的產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE檢測，結(jié)果在約25ku處可見表達(dá)條帶，與預(yù)期蛋白大小相一致（圖4），而未誘導(dǎo)菌和空載體菌均沒有出現(xiàn)此蛋白條帶，與誘導(dǎo)前對照菌相比，誘導(dǎo)5h時(shí)表達(dá)量最高。

圖3 重組質(zhì)粒pET－28a（＋）－SFN的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of the plasmid pET－28a（＋）－SFN by double enzyme digestion

圖4 誘導(dǎo)不同時(shí)間重組菌的SDS－PAGE分析Fig.4 SDS－PAGE of the expressed recombinant protein induced in different time

2.4 純化S蛋白的Western blot檢測

收集誘導(dǎo)5h后的菌體沉淀進(jìn)行超聲波裂解，對裂解上清和裂解沉淀進(jìn)行SDS－PAGE分析可知蛋白是以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)。對裂解沉淀進(jìn)行處理后用His標(biāo)簽純化試劑盒對菌體裂解蛋白進(jìn)行對純化。SDS－PAGE分析可知純化效果較好，洗脫峰1和2蛋白量較大（圖5）。用兔抗PEDV的陽性血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，對洗脫峰2進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果顯示，在一抗為1∶100和二抗為1∶1 000時(shí)pet－28a（＋）－SFN陽性菌表達(dá)產(chǎn)物就可出現(xiàn)大小約25ku的特異性反應(yīng)條帶（圖6），表明重組蛋白可被PEDV陽性免疫血清識(shí)別。

2.5 ELISA檢測方法

經(jīng)過多次試驗(yàn)分析，最終確定了ELISA檢測方法的條件：HB／FN病毒抗原經(jīng)4℃包被過夜，洗滌；用封閉液（含50mL／L犢牛血清的PBST）37℃封閉1h；加入用封閉液進(jìn)行1∶100倍稀釋的待檢血清100μL，于37℃反應(yīng)1h，洗滌；加入用封閉液進(jìn)行1∶1 000倍稀釋的二抗100μL，于37℃反應(yīng)45 min，洗滌；加入100μLTMB顯色液避光顯色15 min；加入終止液50μL后測定OD450nm值。

2.6 重組蛋白的免疫原性分析

純化的S蛋白用SDS－PAGE和 Western blot分析后用超微量紫外分光光度計(jì)測蛋白濃度，重復(fù)5次。分別為0.409，0.413，0.391，0.399，0.402 mg／mL，取其平均值約為0.4mg／mL。將純化的S蛋白分別用弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑按1∶1比例混合乳化，接種6周齡～8周齡SPF級(jí)Balb／c小鼠5只，每只250μL，對照組不接種。分別于免疫前、首免后7、14、21d時(shí)尾靜脈采血，檢測小鼠抗體（表1）。在第14天時(shí)小鼠的抗體水平明顯超過對照組，在免疫后21d血清OD450nm值達(dá)到1.0以上。

圖5 S蛋白純化的SDS－PAGE分析Fig.5 SDS－PAGE analysis of S protein purification

表1 抗體效價(jià)的ELISA檢測結(jié)果均值（OD450nm）Table 1 Average results of antibody titers detected by ELISA（OD450nm）

圖6 純化S蛋白的Western blot檢測Fig.6 Western blot detection of purified S protein

3 討論

近年來，各類病毒引起的仔豬腹瀉極為流行，嚴(yán)重影響仔豬的生長發(fā)育，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所對豬的幾種腹瀉病進(jìn)行RT－PCR檢測的結(jié)果顯示［6］，我國的養(yǎng)豬業(yè)因病毒感染而導(dǎo)致腹瀉的主要病毒中，PEDV占46%，豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PRV）占8%，豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）占15%，可見PEDV儼然成為當(dāng)前國內(nèi)豬群腹瀉流行的最主要原因。PEDV感染無特效治療藥物，且PED與其他腹瀉類疾病在臨床上區(qū)別難度大。研究發(fā)現(xiàn)，PEDV最早排毒出現(xiàn)在感染后2d到6d，在癥狀出現(xiàn)前即排毒，臨床癥狀消失后很長一段時(shí)間仍可在其糞便中要檢出［11］。因而，建立新型科學(xué)便捷的檢測方法可有效防止病毒傳染。

病毒可以作為抗原包被ELISA板建立檢測方法，但PEDV細(xì)胞培養(yǎng)病毒難度大，病毒產(chǎn)量低，一定程度限制了檢測抗原的大量制備［12－13］，使得細(xì)胞毒臨床應(yīng)用價(jià)值低，僅局限于實(shí)驗(yàn)室檢測。目前，檢測PEDV抗體的主要診斷技術(shù)有病毒中和試驗(yàn)（VN）、免疫熒光抗體試驗(yàn)（IFA）和ELISA 等［1］，但缺點(diǎn)是耗時(shí)和昂貴，膠體金試紙條作為新興的檢測方法，具有快速準(zhǔn)確方便等特點(diǎn)，符合基層的需要。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)得到了華北地區(qū)的7段M基因［14］，5段S基因，全部登陸于Gen－Bank。國內(nèi)其他實(shí)驗(yàn)室的PEDV M蛋白的單抗制備也在進(jìn)行中［15］。由于S基因全長4 152bp，編碼1 383個(gè)氨基酸殘基，完整的S基因擴(kuò)增和表達(dá)難度大，所以國內(nèi)外的抗原研究集中在M蛋白上，對于S蛋白和N蛋白等的研究還很少。S蛋白是暴露于病毒表面的纖突蛋白，且產(chǎn)生的抗體水平持續(xù)時(shí)間比M蛋白要長，用S蛋白作為檢測抗原更可靠。

綜上所述，對從PEDV HB／FN株中擴(kuò)增得到的S基因片段進(jìn)行克隆，選取其中一段抗原性較高的片 段，構(gòu) 建 pET－28a（＋）－SFN、pET－32a（＋）－SFN、pGEX－6p－1－SFN 3種表達(dá)系統(tǒng)。作為原核表達(dá)體系的優(yōu)化，表達(dá)的溫度和IPTG的濃度對表達(dá)水平影響也很大。一般在15℃～42℃之間都能獲得成功表達(dá)，但表達(dá)每一種特定蛋白質(zhì)的最適溫度范圍則可能很窄，只有2℃～4℃的范圍［16］。經(jīng)分析，這3種表達(dá)載體在IPTG終濃度為1mmol／L，28℃誘導(dǎo)后都出現(xiàn)了對應(yīng)的目的條帶。表達(dá)載體pET－28a（＋）－SFN表達(dá)的S蛋白量大，且分子質(zhì)量小，僅為25ku。利用pET－28a（＋）載體帶有特異的6×His標(biāo)簽，對重組蛋白進(jìn)行純化得到了0.4 mg／mL的S蛋白。Western blot分析可看出純化的S蛋白可以與兔免疫PEDV血清反應(yīng)。將純化的S蛋白免疫小鼠，小鼠抗體水平在免疫后14d抗體水平明顯高于對照組，試驗(yàn)說明純化的S蛋白具有很好的免疫原性，可用作免疫蛋白進(jìn)行后續(xù)研究。利用親和層析純化帶有6×His的重組S蛋白，可以作為一種新型制備PEDV檢測抗原的方法。將制備基于S蛋白的PEDV免疫膠體金檢測試紙條，從而快速檢測PEDV抗體，用于豬流行性腹瀉病毒的早期檢測。

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