丁 維，賈杏林，芮小慶，申艷輝

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128）

脂質(zhì)體是一種利用天然材料磷脂和膽固醇制備的類似細(xì)胞膜的生物制品，具有良好的生物相容性和靶向性，能降低藥物毒性。在藥學(xué)領(lǐng)域脂質(zhì)體作為類生物膜和藥物載體被廣泛用于實(shí)驗(yàn)研究［1］。利用脂質(zhì)體包裹血紅蛋白，具有可控制大小，同時(shí)脂質(zhì)體可以屏蔽無基質(zhì)血紅蛋白的毒副作用，且延長血紅蛋白的血漿半衰期，無紅細(xì)胞表面的抗原決定簇，保存時(shí)間長達(dá)6個(gè)月等特點(diǎn)［2－4］。豬紅細(xì)胞是來源廣泛的血液代用品制備材料，經(jīng)酶處理后的豬紅細(xì)胞和血紅蛋白可多次輸給犬［5－6］，豬紅細(xì)胞也用于兔的失血休克的搶救試驗(yàn)，證明豬紅細(xì)胞對兔失血性休克有良好的急救作用［7］。豬源血紅蛋白脂質(zhì)體是制備動(dòng)物通用紅細(xì)胞的一個(gè)比較有前景的方法，可以克服動(dòng)物血型多、產(chǎn)生的輸血反應(yīng)和同源輸血導(dǎo)致動(dòng)物疾病的傳播等妨礙動(dòng)物臨床輸血發(fā)展的難題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 0.52kg健康貓1只，7.5kg杜長大三元健康仔豬1頭。

1.1.2 藥品與試劑 大豆卵磷脂，膽固醇，氯仿，無菌生理鹽水，肝素。

1.1.3 儀器 BC－2008Vet血液分析儀，Uritest－150型尿液分析儀，超凈工作臺(tái)，離心機(jī)，顯微鏡，離心管，一次性使用無菌注射器。

1.2 方法

1.2.1 無菌采血 取健康豬血液，抗凝保存。

1.2.2 血紅蛋白的分離及純化 將無菌采取的新鮮豬血經(jīng)脹破法［8］得到血紅蛋白溶液。將得到的上清液依次通過5.0、1.2、0.22μm 微孔濾膜過濾，得到無基質(zhì)豬血紅蛋白。

1.2.3 脂質(zhì)體包裹血紅蛋白的制備 200mg大豆卵磷脂和100mg膽固醇充分溶于20mL氯仿中，再加入10mL提純的濃度為133.3g／L的豬血紅蛋白溶液，將混合溶液加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，轉(zhuǎn)速為90 r／min，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)加熱，超聲離心，分離和收集人工紅細(xì)胞。

1.2.4 輸注前體外配血試驗(yàn) 取20μL豬血紅蛋白脂質(zhì)體和40μL貓全血混合，室溫放置15min，肉眼和顯微鏡下觀察紅細(xì)胞凝集程度，無凝集反應(yīng)則可進(jìn)行輸血。

1.2.5 輸血及貓的各項(xiàng)指標(biāo)檢查 輸入5mL豬血紅蛋白脂質(zhì)體，觀察輸血前、中、后貓?bào)w溫、心跳、精神狀態(tài)以及檢測輸血前后血常規(guī)，尿常規(guī)。

2 結(jié)果

2.1 體外配血試驗(yàn)

紅細(xì)胞無凝集反應(yīng)和溶血反應(yīng)。

2.2 輸血前后貓臨床指標(biāo)變化

輸血前正常。輸血中和輸血后貓精神沉郁，體溫升高，心跳呼吸加快，可視黏膜顏色正常。

2.3 輸血前后體溫變化

從圖1中可以看出輸血后貓的體溫變化不大，在第4天達(dá)到頂峰，隨后恢復(fù)正常。

圖1 貓輸血前后體溫變化Fig.1 The changes of temperature in cat before and after blood transfusion

2.4 輸血前后脈搏的變化

在圖2中輸血后心跳逐漸升高，在第4天達(dá)到峰值，然后逐漸降低，在第6天左右逐漸恢復(fù)到輸血前水平。

圖2 貓輸血前后心跳數(shù)變化Fig.2 The changes of number of heartbeats in cat before and after blood transfusion

2.5 輸血前后血常規(guī)變化

在圖3中貓紅細(xì)胞在輸血后會(huì)緩慢的增加?？傮w而言，紅細(xì)胞數(shù)目的變化不明顯。

圖3 貓輸血前后紅細(xì)胞數(shù)目變化Fig.3 The changes of number of erythrocytes in cat before and after blood transfusion

在圖4中貓白細(xì)胞數(shù)目在輸血后第1天開始上升，在第2天后開始降低。在第4天逐漸恢復(fù)。

在圖5中貓血紅蛋白數(shù)目在輸血后升高，然后逐漸回復(fù)到正常水平。

圖4 貓輸血前后白細(xì)胞數(shù)目含量變化Fig.4 The changes of number of white blood cells in cat before and after blood transfusion

圖5 貓輸血前后血紅蛋白含量變化Fig.5 The changes of hemoglobin content in cat before and after blood transfusion

2.6 輸血前后尿常規(guī)變化

從圖6～圖8中可以看出，膽紅素、蛋白質(zhì)、尿膽原含量變化趨勢相似，在輸血后均明顯升高，在第5天到第6天后膽紅素、尿膽原含量基本恢復(fù)正常值，并趨于穩(wěn)定。其中尿蛋白在第2天達(dá)到最高后逐步下降，第5天恢復(fù)正常。

圖6 貓輸血前后膽紅素含量變化Fig.6 The changes of bilirubin content in cat before and after blood transfusion

圖7 貓輸血前后尿蛋白含量變化Fig.7 The changes of protein content in cat before and after blood transfusion

圖8 貓輸血前后尿膽原含量變化Fig.8 The changes of urobilinogen content in cat before and after blood transfusion

3 討論

血源的缺乏使得血液替代品一直是國際醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其中血液替代品也已經(jīng)發(fā)展到類似于天然紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。脂質(zhì)體包裹血紅蛋白制劑與紅細(xì)胞類的載氧血液替代品相比屬于細(xì)胞型血紅蛋白，表面不存在抗原，不會(huì)引起機(jī)體的排斥反應(yīng)。因此，血紅蛋白脂質(zhì)體可以作為一種新的輸血制劑用于貧血的治療［9－12］。Terajima K等［13］的研究表明，通過檢測血流動(dòng)力學(xué)、血液平均動(dòng)脈血壓、中心靜脈壓，心臟指數(shù)值在液體休克復(fù)蘇時(shí)脂質(zhì)體包封血紅蛋白可以保護(hù)微循環(huán)免受損傷。本試驗(yàn)中在豬血紅蛋白脂質(zhì)體輸入受體貓?bào)w內(nèi)后一段時(shí)間內(nèi)，通過連續(xù)的監(jiān)測血常規(guī)和尿常規(guī)的方法，結(jié)果貓?jiān)谡麄€(gè)試驗(yàn)中沒有發(fā)生輸血反應(yīng)，證明豬血紅蛋白脂質(zhì)體對貓是安全可用，目前國內(nèi)外暫時(shí)還未見相關(guān)報(bào)道。

本研究中貓尿液中尿膽原以及膽紅素升高后再恢復(fù)正常，說明豬血紅蛋白在貓?bào)w內(nèi)存在大約2d～3d左右，相比而言無基質(zhì)血紅蛋白的半衰期只有4 h左右［14］，其在機(jī)體內(nèi)存在時(shí)間較長。但在實(shí)驗(yàn)中貓仍然表現(xiàn)出輕微的發(fā)熱反應(yīng)，呼吸數(shù)增加，且白細(xì)胞的數(shù)目也會(huì)升高，對貓的免疫系統(tǒng)還是有一定的影響。因此，如何改進(jìn)脂質(zhì)體包裹血紅蛋白減少對機(jī)體的副作用以及延長半衰期，還需要進(jìn)一步的研究。

豬血紅蛋白脂質(zhì)體能迅速恢復(fù)動(dòng)物機(jī)體血壓，具有有效擴(kuò)充血容量并向組織供氧、復(fù)蘇瀕臨死亡動(dòng)物的功能。由于豬血紅蛋白來源廣泛，經(jīng)過脂質(zhì)體包裹后的豬血紅蛋白脂質(zhì)體是異源輸血豐富的血液來源，這種安全、來源廣泛、價(jià)格低廉的動(dòng)物血液替代品的載氧制劑在寵物市場上具有很大的應(yīng)用前景。

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