馬 玢，曾 瑾，李 武，劉曉明，鄧光存＊

（1.寧夏大學(xué) 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏銀川750021）

牛結(jié)核病（Bovine tuberculosis）是由牛分支桿菌（Mycobacterium bovis，MTB）引起的慢性人獸共患傳染病。由于人類和牛的關(guān)系（牛肉，牛奶及奶制品等）較為密切，人可以通過與牛接觸或食用牛肉、牛奶等制品而感染結(jié)核病。研究表明，約10%左右的人結(jié)核病是由牛分支桿菌所引起［1］。由此可見，該病的流行與傳播不僅嚴重影響畜牧業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展，而且威脅到人類的健康，被WHO列為必須報告的傳染病。早在1960年，世界衛(wèi)生組織（WHO）的專家就指出，除非消滅牛結(jié)核病，否則人類結(jié)核病的控制不會成功?？ń槊纾˙CG）是預(yù)防結(jié)核病的惟一疫苗，但由于它的免疫保護效力不穩(wěn)定，對人群的保護率介于0～80%之間［2］。而對于牛來講，接種BCG后，會干擾牛結(jié)核菌素（PPD）的檢測結(jié)果，導(dǎo)致人工免疫和自然感染不能區(qū)別，影響牛的檢疫和國際貿(mào)易。因此，為控制牛結(jié)核病的傳播流行，研制開發(fā)一種有效且高效的牛結(jié)核病新型疫苗迫在眉睫。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)分支桿菌培養(yǎng)液中的分泌蛋白對于結(jié)核病的保護性免疫很重要，對結(jié)核病的預(yù)防和診斷具有重要的意義［3］。Ag85復(fù)合物是分支桿菌培養(yǎng)濾液中的主要分泌蛋白之一，包括Ag85A、Ag85B、Ag85C三種成分，其中Ag85B是機體的保護性抗原，具有高度的保護力。Ag85B可誘導(dǎo)特異性Th1型細胞免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)IFN－γ的產(chǎn)生及CTL反應(yīng)。因此，它是開發(fā)新型抗結(jié)核藥物作用的靶位點，也是開發(fā)新型疫苗的候選抗原。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 牛分支桿菌C68001株基因組DNA、BL21（DE3）菌株、質(zhì)粒載體pET－28a（＋）由西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室保存；Trans1－T1Phage Resistant感受態(tài)細胞購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 dNTPs、TransTaqTMDNA聚合酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；10×Ex Taq buffer、T4DNA Ligase、2×T4Buffer、NdeⅠ、HindⅢ，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；Wizard PCR preps DNA Purification System DNA凝膠回收與純化試劑盒Promega公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量提取試劑盒，天根公司產(chǎn)品；抗His標簽小鼠單克隆抗體、HRP－羊抗鼠IgG，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Western blot ECL，環(huán)亞生物公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 ag85b基因引物設(shè)計 根據(jù)GenBank報道的牛分支桿菌（AF2122／97）ag85b基因核酸序列及其His標簽位置的考慮，設(shè)計了2條PCR引物，P1為 5′－CGCCATATGACAGACGTGAGCCGA－3′，P2 為 5′－CCCAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA－3′。引物中含有NdeⅠ和HindⅢ酶切位點，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 目的基因的PCR擴增 以牛分支桿菌C68001株基因組DNA為模板，擴增ag85b基因：即以P1、P2為引物，PCR反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃45s，62℃45s，72℃50s，共30個循環(huán)；72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。取其擴增產(chǎn)物在10g／L的瓊脂糖凝膠中電泳檢查，并按 Wizard PCR preps DNA Purification SystemDNA凝膠回收與純化試劑盒進行回收純化。將擴增的目的基因與Trans1－T1載體連接后進行測序。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ和HindⅢ 分別對純化的ag85b基因的擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET－28a（＋）進行雙酶切，將雙酶切得到的ag85b基因和質(zhì)粒pET－28a（＋）DNA連接，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，涂布于含有30μg／mL卡那霉素的LB培養(yǎng)平皿中，37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.4 重組質(zhì)粒的鑒定 從瓊脂平板上挑取單個轉(zhuǎn)化菌落，接種于10mL含有30μg／mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，180r／min振蕩過夜。利用小提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，分別進行PCR鑒定和NdeⅠ、HindⅢ 雙酶切鑒定，在10g／L的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5 Ag85B蛋白的誘導(dǎo)表達 將陽性重組菌株接種于10mL含有30μg／mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至A600值為0.5～0.7時，加入IPTG至終濃度1mmol／L，37℃誘導(dǎo)表達4h～5h，收集菌體。以同樣的方法誘導(dǎo)空載體pET－28a作為對照。

1.2.6 重組表達產(chǎn)物的SDS－PAGE和免疫印跡（Western blot）分析 以空載體的轉(zhuǎn)化菌為陰性對照，收集誘導(dǎo)表達后的菌體，冰浴超聲破碎離心后，分別收集上清和包涵體沉淀，上樣于180g／L聚丙烯酰胺凝膠中進行SDS－PAGE分析，以確定Ag85B表達及其在大腸埃希菌中的表達形式。電泳結(jié)束后用半干電轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，經(jīng)50g／L脫脂奶粉封閉1h，洗滌后再與1∶1 000倍稀釋的抗His標簽小鼠單克隆抗體在4℃條件下反應(yīng)過夜，洗滌后再與1∶5 000的HRP－羊抗鼠IgG 37℃反應(yīng)1h，充分洗滌后，用 Western blot ECL試劑盒化學(xué)發(fā)光曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 ag85b基因的PCR擴增

將擴增產(chǎn)物以10g／L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果與預(yù)期擴增片段大小一致，大小為978bp（圖1）。

將目的基因測序后與GenBank報道的牛分支桿菌（AF2122／97）ag85b基因的核酸序列進行比對，結(jié)果表明已成功克隆了ag85b基因。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a－ag85b分別進行PCR鑒定和NdeⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，可見擴增的產(chǎn)物與預(yù)期大小相一致，大小為978bp（圖2）。雙酶切結(jié)果與預(yù)期一致，大小為978bp（圖3）。

圖1 ag85b基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR products of ag85b gene

圖2 pET28a－ag85b質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 PCR analysis result of recombinant pET28a－ag85b plasmid

2.3 Ag85B重組蛋白的表達及鑒定

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)Ag85B，由SDS－PAGE結(jié)果分析為沉淀部分有明顯的特異蛋白表達帶，其分子質(zhì)量為33ku；在大腸埃希菌BL21（DE3）中以包涵體形式存在（圖4），Western blot鑒定結(jié)果表明，該蛋白能被His單克隆抗體特異識別，在約33ku處有1反應(yīng)條帶，對照組空載體pET28a無相應(yīng)條帶（圖5），表明表達的蛋白為目的蛋白Ag85B。

圖3 pET28a－ag85b質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant pET28a－ag85b plasmid by restrictive enzyme digestion

圖4 SDS－PAGE分析重組Ag85B在大腸埃希菌中的表達Fig.4 SDS－PAGE analysis of recombinant Ag85B expressed in E.coli BL21（DE3）

3 討論

目前，國內(nèi)外研究較多的結(jié)核分支桿菌免疫優(yōu)勢抗原蛋白主要有 Ag85復(fù)合物，CFP－10，ESAT－6，MPB64，MPB70和 MPB83等?？乖瑼g85復(fù)合物是結(jié)核桿菌在生長過程中分泌到細胞外的，分子質(zhì)量大小為30ku～32ku，是分支桿菌屬共有蛋白。Ag85復(fù)合蛋白包括Ag85A、Ag85B和 Ag85C，其中Ag85A（也稱P32、MPB44）為15%，Ag85B（也稱a－Ag、MPB59）為22%，Ag85C為8%，該復(fù)合物屬于分支桿菌酸轉(zhuǎn)移酶，在分支桿菌細胞壁的合成及其結(jié)合纖連蛋白起著重要的作用［4］。其中，Ag85B是抗結(jié)核免疫中的主要保護性抗原，其抵抗結(jié)核分支桿菌再感染的能力優(yōu)于BCG，是開發(fā)新型疫苗的理想候選抗原［5－8］。研究表明，Ag85B導(dǎo)致的細胞免疫反應(yīng)最強，可誘導(dǎo)實驗動物產(chǎn)生特異性Th1型細胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)IFN－γ的產(chǎn)生及CTL反應(yīng)［9］。另外，Ag85B與其他抗原蛋白所融合的新型疫苗能顯著地提高細胞免疫應(yīng)答，抑制結(jié)核分支桿菌的生長，并有效地誘導(dǎo)特異性Th1型細胞免疫反應(yīng)［10－14］。T－bet佐劑結(jié)合Ag85B的DNA疫苗與Ag85B單獨的DNA疫苗或空載體相比，不僅能誘導(dǎo)機體以Th1型免疫反應(yīng)為主，引起明顯較高的IgG2a抗體反應(yīng)，并增加 γ干擾素（IFN－γ）的產(chǎn)量［5，8］。Ballester M等［6］研究表明，用納米材料聚丙烯硫化物包裹結(jié)核抗原蛋白Ag85B制成的納米疫苗與佐劑CpG混合后，通過對小鼠肺部給藥的方式發(fā)現(xiàn)可以增強在脾臟的Th1型免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)作用。Van Dissel J T等［7］研究表明，由 Ag85B－ESAT－6融合蛋白與IC31佐劑相結(jié)合制成的新型疫苗可以增強T細胞的抗原特異性反應(yīng)，并能持久的誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。融合蛋白Ag85B－Esat6－HspX的DNA疫苗能夠顯著提高IFN－γ和IL－2的表達水平，并能有效的誘導(dǎo)Th1型細胞免疫應(yīng)答［15］。以上研究提示，Ag85B是結(jié)核病新型疫苗研究的理想抗原之一。

圖5 Ag85B蛋白Western blot結(jié)果Fig.5 Western blot analysis of recombinant Ag85Bproteins

本研究克隆了免疫優(yōu)勢抗原基因ag85b，構(gòu)建了重組基因工程菌株并進行了誘導(dǎo)表達，表達的蛋白經(jīng)過Western blot分析證實能被特異性抗體識別，為下一步研制牛結(jié)核病新型疫苗及診斷制劑奠定了基礎(chǔ)。

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