張宇驕，劉 玲，汪春燕，詹 平，伍宗惠，何 雯，王定玉

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川瀘州646000）

子宮內(nèi)膜癌為女性生殖系統(tǒng)常見三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%。子宮內(nèi)膜癌早期診斷和治療預(yù)后較好，但一旦轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，5年生存率降低70%。不典型增生使癌變的風(fēng)險(xiǎn)較高，但單純性增生和復(fù)雜性增生發(fā)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)低，子宮內(nèi)膜癌可能存在誤診或治療過度的傾向［1］，因此尋找新的預(yù)測風(fēng)險(xiǎn)的腫瘤標(biāo)記物是診治研究的重點(diǎn)。LRP16基因在雌激素相關(guān)腫瘤中表達(dá)升高，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系。本研究應(yīng)用WST－1法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）技術(shù)等來探討子宮內(nèi)膜癌組織和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC－1－B細(xì)胞中LRP16表達(dá)的變化及其在細(xì)胞增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2008年10月至2010年3月在本科室進(jìn)行手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者的組織標(biāo)本26例。26例內(nèi)膜癌組織病理診斷為高分化腺癌10例，中分化腺癌10例，低分化腺癌6例，其中雌激素受體（ER）陽性患者19例，ER陰性患者

7例；根據(jù)2009FIGO子宮內(nèi)膜癌手術(shù)病理分期Ⅰ期19例，Ⅱ期3例，Ⅲ期3例，Ⅳ期1例。另取同期良性疾?。ㄗ訉m肌瘤或子宮腺肌瘤）手術(shù)患者的正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本10例作為對照，患者平均年齡為51歲。所有患者術(shù)前均未接受放、化療。

1.2 試劑 實(shí)驗(yàn)所用LRP16真核表達(dá)載體EX－Y2069－M29、空質(zhì)粒EX－NEG－M29由本實(shí)驗(yàn)組構(gòu)建。人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC－1－B購自上海中科院細(xì)胞庫。RNA提取試劑盒及RTPCR試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品，PCR引物由上海生物工程公司合成，WST－1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 LRP16mRNA表達(dá)的檢測 采用Invitrogen公司的Trizol反應(yīng)試劑盒提取正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜癌組織總的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以LRP16和β－action（作為內(nèi)參照）引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的定性檢測。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染克隆的篩選 HEC－1－B細(xì)胞用含10% 小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、EX－Y2069－M29組、EX－NEG－M29組。第1組中加入無質(zhì)粒的脂質(zhì)體稀釋液，第2組中加入70μL EX－Y2069－M29－Opti－Lipofecter復(fù)合物，第3組中加入70μL EX－NEG－M29－Opti－Lipofecter復(fù)合物，輕輕混勻，置37℃5%CO2的孵箱培養(yǎng)，5h后換成無雙抗新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48h后，3組細(xì)胞同時加入濃度為400μg／mL的G418選擇培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，每3天換液1次，篩選抗G418克隆，挑選陽性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：將HEC－1－B細(xì)胞接種于24孔板，在轉(zhuǎn)染48h后用RT－PCR法檢測LRP16基因的表達(dá)。

1.3.3 轉(zhuǎn)染克隆的鑒定 收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，采 用 RT－PCR 法 檢 測 HEC－1－B 細(xì) 胞 LRP16 基 因 的表達(dá)。

1.3.4 細(xì)胞生長曲線的繪制 收獲對數(shù)生長期的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染HEC－1－B細(xì)胞，每孔2×104個細(xì)胞接種于6孔板中，次日開始每天計(jì)數(shù)各組的細(xì)胞數(shù)量，連續(xù)計(jì)數(shù)7d，繪制生長曲線。

1.3.5 WST－1檢測細(xì)胞增殖 收集對數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染HEC－1－B細(xì)胞，每孔6×104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%時，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)設(shè)3組即：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組 HEC－1－B細(xì)胞，每組5個復(fù)孔。向每孔中各加入10μL 5mg／mL WST－1液，37℃5%CO2飽和濕度下孵育5h，分別在第24、48、72小時用酶標(biāo)儀測定450nm波長時每孔的光密度（OD）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 LRP16mRNA在子宮內(nèi)膜癌、正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá) 26例子宮內(nèi)膜癌組織中有21例LRP16mRNA陽性（83.33%），LRP16mRNA的平均表達(dá)水平為0.82±0.21；10例子宮內(nèi)膜組織中有3例LRP16mRNA陽性（30.00%），LRP16 mRNA的平均表達(dá)水平為0.47±0.18；LRP16mRNA的陽性表達(dá)率及表達(dá)水平分別比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 基因轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染克隆的篩選與鑒定 HEC－1－B細(xì)胞在G418篩選培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)1個月后，未轉(zhuǎn)染的HEC－1－B細(xì)胞全部死亡。維持選擇培養(yǎng)2周時，實(shí)驗(yàn)組和空載體組分別獲得抗G418克隆，大量擴(kuò)增抗性細(xì)胞，并傳代培養(yǎng)，分別命名為EX－Y2069－M29（轉(zhuǎn)染LRP16cDNA）和EX－NEG－M29（轉(zhuǎn)染空載體）。RT－PCR法檢測顯示，未轉(zhuǎn)染組及EX－NEG－M29組和EX－Y2069－M29組的 HEC－1－B細(xì)胞均有LRP16基因表達(dá)，未轉(zhuǎn)染組和 EX－NEG－M29組的表達(dá)量分別為0.123 1±0.036 6、0.148 6±0.028 7，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；EX－Y2069－M29組表達(dá)量為0.506 0±0.019 8，未轉(zhuǎn)染組、EX－NEG－M29組、EX－Y2069－M29組三者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EX－Y2069－M29組表達(dá)明顯增高，見圖1。

圖1 RT－PCR產(chǎn)物凝膠電泳

2.3 LRP16對HEC－1－B細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖速度明顯低于非轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長速率低于對照組未轉(zhuǎn)染HEC－1－B細(xì)胞；自轉(zhuǎn)染的24h起，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長明顯低于未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，增殖明顯減慢（圖2）。WST－1法檢測結(jié)果顯示LRP16轉(zhuǎn)染組較陰性對照組、空載體轉(zhuǎn)染組任意一組間HEC－1－B細(xì)胞OD值低（P＜0.05）；陰性對照組和空載體轉(zhuǎn)染組OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

圖2 HEC－1－B細(xì)胞的生長曲線

表1 各組細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的OD（A450）值（±s）

表1 各組細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的OD（A450）值（±s）

時間 陰性對照組 空質(zhì)粒組 LRP16組24h0.349 3±0.019 9 0.339 0±0.015 9 0.349 3±0.013 9 48h0.590 0±0.029 6 0.586 0±0.011 1 0.425 7±0.021 4 72h0.806 0±0.045 6 0.840 3±0.022 7 0.575 0±0.019 0 96h0.971 3±0.025 0 0.957 3±0.022 4 0.636 7±0.011 1

3 討 論

在既往對細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)人體各種組織細(xì)胞內(nèi)均有不同程度的LRP16表達(dá)，該基因在人類多種腫瘤細(xì)胞如乳腺癌等中的表達(dá)量明顯高于其正常對應(yīng)組織，尤其是在雌激素依賴性的腫瘤中表達(dá)量增高更明顯，而在已公認(rèn)的與雌激素?zé)o關(guān)的腫瘤中和雌激素受體陰性的腫瘤中，LRP16基因的表達(dá)低，LRP16的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系［2－3］。研究表明，LRP16是雌激素反應(yīng)性識別靶基因，雌激素誘導(dǎo)LRP16的表達(dá)上調(diào)，具體調(diào)控途徑由ERa介導(dǎo)［4］。在細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，ERa陽性乳腺癌細(xì)胞和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中LRP16的表達(dá)水平依賴于雌激素活性；過表達(dá)的LRP16通過增強(qiáng)雌激素激活ERa功能從而促進(jìn)人乳腺癌 MCF－7細(xì)胞的增殖，抑制LRP16基因的表達(dá)通過上調(diào)ERa介導(dǎo)的E－cadherin表達(dá)從而抑制雌激素反應(yīng)性乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲能力［5－6］。Han等［5］觀察到乳腺癌 MCF－7細(xì)胞 LRP16表達(dá)下調(diào)后，雌激素并沒有促進(jìn)細(xì)胞的生長，下調(diào)LRP16破壞了雌激素刺激細(xì)胞生長的作用。此外，LRP16mRNA的表達(dá)水平與乳腺癌的病理分級呈正相關(guān)［7］。由此表明，LRP16在致癌過程中起著重要的作用，通過激活ERa調(diào)控激素依賴性腫瘤的進(jìn)展。大量研究表明，ERa與雌激素依賴性腫瘤的治療及預(yù)后判斷密切相關(guān)，LRP16與ERa之間存在表達(dá)調(diào)控與反饋激活的作用，所以檢測腫瘤中LRP16的表達(dá)水平具備了反映ERa信號活性的良好特征，鑒于LRP16蛋白的功能特征，檢測雌激素相關(guān)腫瘤中LRP16的表達(dá)應(yīng)優(yōu)于檢測腫瘤中ERa本身的含量及其目前臨床上使用的任何一個靶蛋白的水平。作為激素相關(guān)的惡性腫瘤的診斷及預(yù)后判斷指標(biāo)，LRP16可能成為反映該類腫瘤預(yù)后標(biāo)志物，進(jìn)一步探索LRP16和ER相互作用的分子生物學(xué)機(jī)制，以及ER調(diào)控下游基因的機(jī)制和通路，為進(jìn)一步探索該類腫瘤形成和進(jìn)展機(jī)制創(chuàng)造了條件。

該研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中LRP16mRNA的陽性表達(dá)率及表達(dá)水平均高于正常子宮內(nèi)膜組織，由此推測LRP16與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程，同既往的研究結(jié)果相似，其可能成為子宮內(nèi)膜癌診斷和預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)記物。該研究發(fā)現(xiàn)，LRP16轉(zhuǎn)染組HEC－1－B細(xì)胞在體外能繼續(xù)增殖，說明利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染LRP16基因到子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC－1－B是安全可行的，并可使LRP16基因獲得穩(wěn)定表達(dá)，為下一步研究LRP16基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖情況的影響，探討LRP16基因的分子生物學(xué)機(jī)制及對子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的影響打下基礎(chǔ)。但HEC－1－B細(xì)胞增殖能力明顯下降，由此可見，LRP16基因表達(dá)上調(diào)并沒有促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌HEC－1－B細(xì)胞的增殖，其可能通過增加HEC－1－B細(xì)胞的體外侵襲、生長能力參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展［8］，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。LRP16基因參與致癌過程，參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程，可望通過選擇性阻遏LRP16基因表達(dá)，抑制正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變，治愈子宮內(nèi)膜惡性腫瘤，從而為分子水平治愈激素相關(guān)性疾病開辟廣闊的治療前景。

［1］ Sherman ME.Theories of endometrial carcinogenesis：a multidisciplinary approach［J］.Mod Pathol，2000，13（3）：295－308.

［2］ 韓為東，樓方定，于力，等.LRP16基因的SAGE譜分析及其在正常血細(xì)胞、白血病細(xì)胞中的表達(dá)狀況［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，23（3）：161－163.

［3］ 韓為東，母義明，盧學(xué)春，等.雌激素通過其受體上調(diào)LRP16mRNA表達(dá)并促進(jìn) MCF－7細(xì)胞增殖［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2004，20（2）：165－168.

［4］ Han WD，Zhao YL，Zang YL，et al.Up－regulation of LRP16mRNA by 17beta－estradiol through activation of estrogen receptor alpha（ERalpha），but not ERbeta，and promotion of human breast cancer MCF－7cell proliferation：apreliminary report［J］.Endocr Related Cancer，2003，10（2）：217－224.

［5］ Han WD，Zhao YL，Meng YG，et al.Estrogenically regulated ERαtarget gene LRP16interacts with ERαand enhances the receptor′s transcriptional activity［J］.Endocr Related Cancer，2007，14（3）：741－753.

［6］ Meng YG，Han WD，Zhao YL，et al.Induction of LRP16 gene by estrogen promotes the invasive growth of Ishikawa human endometrial cancer cells through down－regulation of E－cadherin［J］.Cell Research，2007，17（5）：869－880.

［7］ Liao DX，Han WD，Zhao YL，et al.The expression and dinical significance of the LRP16gene in human breast cancer［J］.Chin J Cancer，2006，25（1）：44－49.

［8］ 孟元光，韓為東，黃柯，等.雌激素調(diào)控子宮內(nèi)膜癌IShikawa細(xì)胞中LRP16基因表達(dá)及其意義［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27（11）：980－983.