秦福芳 孫 倩 邵鳳民 閻 磊 (鄭州人民醫(yī)院特需科，河南 鄭州 450003)

腎小球系膜細(xì)胞增生是多種腎小球疾病的病理改變，也是腎小球硬化的重要病理基礎(chǔ)〔1〕。人細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶2(CDK2)作為一種細(xì)胞周期正控蛋白，在細(xì)胞周期G1和S期過(guò)程中有重要的作用〔2〕。血管緊張素Ⅱ (AngⅡ)受體拮抗劑 (ARB)氯沙坦在受體水平阻斷AngⅡ的作用，而該藥物對(duì)腎臟的保護(hù)作用日益受到關(guān)注〔3，4〕。本實(shí)驗(yàn)主要觀察氯沙坦對(duì)T細(xì)胞分化抗原1(Thy1)腎炎大鼠系膜細(xì)胞CDK2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 挑選108只Wistar雄性大鼠，體重160～200 g，采用隨機(jī)方式把大鼠分成三組:(1)對(duì)照組;(2)Thy1腎炎組，尾靜脈注射兔抗大鼠胸腺細(xì)胞血清(0.5 ml/kg);(3)服用氯沙坦的Thy1腎炎組，尾靜脈注射抗血清后立即給予纈沙坦溶液(500 mg/L)每組36只。以1、3、5、7 d為標(biāo)準(zhǔn)把三組分別設(shè)為4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)9只。

1.2 觀察指標(biāo)及方法 (1)腎臟病理:采用4 μm的石蠟切片(HE、PAS、PASM)并用透射電鏡檢查。計(jì)數(shù)腎小球有核細(xì)胞(PAS染色切片)，計(jì)算系膜區(qū)占腎小球面積百分比(PASM染色切片，點(diǎn)計(jì)數(shù)法)。取20個(gè)皮質(zhì)區(qū)的腎小球，計(jì)數(shù)并計(jì)算其平均值。(2)免疫組化:用升汞-苦味酸混合固定液固定腎組織標(biāo)本，隨后用石蠟包埋、切片，保持切片的厚度為4 μm。鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)法檢測(cè)腎小球CDK2和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)情況，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析(CMIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng))。(3)首先分離腎小球，并提取其總蛋白，最后用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白的含量。采用Western印跡分析腎小球CDK2的表達(dá)情況蛋白含量用平均光密度的OD值和其面積的乘積表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料用±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 腎臟病理學(xué)研究 注射兔抗大鼠胸腺細(xì)胞血清(ATS)，1 d后觀察，發(fā)現(xiàn)腎小球內(nèi)部出現(xiàn)了系膜溶解和炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，系膜細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，在少數(shù)腎小球內(nèi)部，毛細(xì)血管發(fā)生擴(kuò)張，最終形成微動(dòng)脈瘤。ATS注射3～7 d后觀察，發(fā)現(xiàn)系膜溶解征逐漸消退，系膜細(xì)胞增生，并且在腎小球內(nèi)部，有核細(xì)胞數(shù)量不斷增多，積聚了大量的系膜基質(zhì)。3～7 d后與Thy 1腎炎組相比，氯沙坦腎炎組的系膜細(xì)胞增生和系膜擴(kuò)張程度較輕，并且縮短了系膜的修復(fù)時(shí)間。見(jiàn)表1。

2.2 免疫組化結(jié)果 對(duì)照組腎小球PCNA的表達(dá)量極少，幾乎沒(méi)有表達(dá)CDK2。對(duì)比而言，在Thy1組和氯沙坦腎炎組的腎小球內(nèi)部，PCNA和CDK2表達(dá)有逐漸增高的趨勢(shì)。在5～7 d時(shí)達(dá)到最高量。在第3、5、7天時(shí)間點(diǎn)，氯沙坦腎炎組PCNA和CDK2表達(dá)低于Thy1組(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 Western印跡分析 對(duì)照組內(nèi)CDK2表達(dá)量最低，并且在腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞增生時(shí)其表達(dá)量增加，第5天時(shí)達(dá)最大值。氯沙坦腎炎組的CDK2比對(duì)照組高，并會(huì)隨增生而表達(dá)量增加表達(dá)量，在第5天時(shí)最高。氯沙坦腎炎組的表達(dá)量明顯低于Thy1組(P＜0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表1 腎小球有核細(xì)胞計(jì)數(shù)及系膜區(qū)面積/腎小球面積的百分比(±s)

表1 腎小球有核細(xì)胞計(jì)數(shù)及系膜區(qū)面積/腎小球面積的百分比(±s)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與氯沙坦腎炎組比較:3)P＜0.05，4)P ＜0.01;下表同

組別 腎小球有核細(xì)胞數(shù)/腎小球系膜區(qū)面積/腎小球面積(%)56.1±9.6 11.43±1.08第3天 56.2±9.5 11.42±1.06第5天 56.3±9.7 11.43±1.07第7天 56.1±9.6 11.43±1.09 Thy1組 第1天 44.1±5.3 9.02±1.80第3天 61.9±7.9 19.0±4.122)第5天 81.5±5.22) 23.88±1.002)第7天 78.9±6.52) 27.01±3.992)氯沙坦腎炎組 第1天 46.1±6.4 9.43±2.01第3天 49.3±7.03) 13.89±1.411)3)第5天 71.1±6.51)4) 17.00±1.922)3)第7天 68.8±8.21)3) 18.99±5.012)4)對(duì)照組 第1天

表2 各組腎小球系膜細(xì)胞PCNA、CDK2的表達(dá)(±s)

表2 各組腎小球系膜細(xì)胞PCNA、CDK2的表達(dá)(±s)

組別 PCNA CDK2 CDK2 Western印跡分析0.40±0.11 7.98±0.88 0.19±0.05第3天 0.41±0.12 7.99±0.83 0.20±0.06第5天 0.43±0.11 7.98±0.87 0.17±0.05第7天 0.40±0.10 8.01±0.89 0.19±0.04 Thy1組 第1天 1.01±0.142) 4.03±0.532) 1.41±0.232)第3天 4.68±1.012) 3.42±0.382) 3.42±0.062)第5天 10.99±1.982) 3.65±0.562) 4.75±0.322)第7天 9.12±1.542) 5.96±0.992) 3.99±0.022)氯沙坦腎炎組 第1天 1.05±0.312) 4.32±0.662) 1.06±0.082)4)第3天3.52±0.332)3)4.98±0.452)4) 2.38±0.032)4)第5天8.01±0.432)3)4.73±0.542)3) 3.04±0.152)4)第7天7.18±0.992)3) 7.22±0.163) 2.73±0.171)3)對(duì)照組 第1天

3 討論

很多腎小球疾病會(huì)表現(xiàn)為腎小球系膜細(xì)胞增殖，因此，研究腎小球系膜細(xì)胞增生的機(jī)制，并最終阻止其發(fā)展有著非常重要的意義。細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)是細(xì)胞周期，各種促增殖因子對(duì)細(xì)胞的影響作用最后會(huì)反映在細(xì)胞周期上。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白會(huì)控制細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，其中一個(gè)重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白是 CDK2〔5〕。

圖1 Western印跡分析CDK2表達(dá)變化

CDK2是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在G1期能與細(xì)胞周期素E結(jié)合，而在S期則和周期素A結(jié)合，進(jìn)而形成周期素，即CDK2復(fù)合物，這種周期素具有全酶活性，能有效促進(jìn)細(xì)胞周期的順利進(jìn)行。用血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)刺激的體外試驗(yàn)，促使系膜細(xì)胞增生，CDK2蛋白水平會(huì)明顯升高〔6〕。在本試驗(yàn)中，正常大鼠腎小球靜止期系膜細(xì)胞的CDK2表達(dá)水平極低。相反，抗Thy6系膜增殖性腎炎模型中CDK2在腎小球系膜細(xì)胞增殖時(shí)有明顯上調(diào)的趨勢(shì)。CDK2表達(dá)水平隨細(xì)胞增生程度的提高而提高。當(dāng)大鼠處于病理狀態(tài)下時(shí)，CDK2的表達(dá)水平與系膜細(xì)胞增生具有顯著相關(guān)性。因此，CDK2作為作用靶點(diǎn)很可能對(duì)系膜增殖性腎炎的治療有重要的意義。Dousa等指出，為有效降低CDK2的表達(dá)，抑制因子Olomousine很可能發(fā)揮重要的作用。病理狀態(tài)下，腎組織局部的AngⅡ濃度可達(dá)到血漿AngⅡ1 000倍左右，能促進(jìn)腎小球疾病的發(fā)生，可見(jiàn)，阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)能防治腎臟疾病〔7，8〕。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氯沙坦能明顯減輕腎炎大鼠的系膜細(xì)胞增生及系膜擴(kuò)張程度，CDK2表達(dá)降低。說(shuō)明氯沙坦在一定程度內(nèi)能抑制腎小球系膜細(xì)胞CDK2的表達(dá)，氯沙坦的作用機(jī)制與其抑制系膜細(xì)胞CDK2表達(dá)相關(guān)。該研究為氯沙坦的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。

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