孫 超，劉志鴻，楊愛國，周麗青，吳 彪，嚴加坤，侯 丫，董春光

（1.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)重點實驗室，中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306）

光滑河藍蛤（Potamocorbula laevis），俗稱藍蛤，隸屬于抱蛤科（Corbulidae）河藍蛤?qū)伲╬otamocorbula），系廣溫性底棲貝類，常棲息于江河口附近水域的軟泥底質(zhì)海底，在我國南北方均有分布。光滑河藍蛤是蝦蟹的可口餌料，具有很大的經(jīng)濟價值。隨著蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)的大規(guī)模發(fā)展，人們在光滑河藍蛤棲息地大規(guī)模捕撈，使光滑河藍蛤種質(zhì)資源遭受了極大破壞，亟需對光滑河藍蛤的種質(zhì)資源現(xiàn)狀進行研究與保護。

線粒體DNA 是環(huán)狀分子，長度在14～17 kb 之間[1]，具有進化速度快、核苷酸替代率高[2]等特點，成為種類鑒別、群體遺傳學等研究的有效遺傳標記[3]。線粒體DNA 基因序列的差異在遺傳多樣性研究中占有非常重要的地位[4-5]。目前國內(nèi)有關(guān)光滑河藍蛤的相關(guān)研究資料較少，在分子方面研究尚未見有報道。對3 個地理群體的光滑河藍蛤的線粒體細胞色素氧化酶（COI）基因片段進行了測序分析，以期為光滑河藍蛤的種質(zhì)資源保護和種群遺傳學研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

光滑河藍蛤3 個群體樣本分別于2012年采自東營，濰坊，日照相關(guān)海域，每個地理群體光滑河藍蛤取樣品數(shù)為10，保存于-80℃冰箱。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA 提取 采用常規(guī)方法抽提DNA，取約20 mg 光滑河藍蛤肌肉組織，加入400 μL TEN 細胞裂解緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH值9.0；100 mmol/L EDTA；200 mmol/L NaCl），剪碎后再加入40 μL SDS（10%）和8 μL 蛋白酶K（10 mg/mL），于56℃水浴鍋內(nèi)消化，直到溶液澄清，用酚、氯仿抽提，異戊醇沉淀，然后用去離子超純水溶解。提取的基因組DNA 定量后配成20 ng/μL 的工作溶液備用。

1.2.2 PCR 擴增與電泳檢測 所用COI 基因引物序列為AR：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATT GG-3′；BR：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAA ATCA-3′，由上海生工合成。PCR 反應(yīng)在Eppendorf擴增儀上進行，30 μL 反應(yīng)體系：3 μL PCR 10×buffer （Mg2+plus），4 μL 2 mmol/L dNTP ，2 μL 10 μmol/L 的AR 與BR 引物，0.5 μL 5 U/μL Taq 酶，2 μL 20 ng/μL DNA，其余為純水。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)多次重復(fù)，PCR 結(jié)束后取樣用瓊脂糖凝膠電泳檢測（1×TBE，5V/cm 恒壓），利用凝膠成像系統(tǒng)（UVP，Biolmaging Systems）進行觀察和拍照。

1.2.3 測序和數(shù)據(jù)處理 PCR 產(chǎn)物由北京華大基因測序，將測序得到的序列用MegAlign 軟件分析其同源性和相對遺傳距離。并用MegAlign 軟件對所獲得的線粒體COI 基因片段序列進行序列比較。用DnaSp4.0 軟件計算群體的單倍體型數(shù)（H）、平均核苷酸差異（K）及核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）。用MEGA5.0 軟件計算序列的堿基組成、變異位點以及遺傳距離，用NJ 法和UPGMA 法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，系統(tǒng)樹各結(jié)點的支持率以序列數(shù)據(jù)集1 000 次重復(fù)抽樣檢驗的自引導值（Boot-Strap value）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體COI 基因片段序列分析

測序得到的目的片段經(jīng)過clustal W 比對后，去除引物及測序起始的部分序列，并經(jīng)過在線BLAST 分析，確認得到665 bp 的COI 基因序列。利用MEGA 軟件計算這段序列的堿基組成（表1），3 個群體堿基組成基本一致，COI 基因序列T、C、A、G 和A+T 的平均含量分別為46.2%、13.3%、21.7%、18.8%及67.9%，A+T 含量顯著高于G+C 含量，這與線粒體DNA 堿基組成特點是相符的。

表1 光滑河藍蛤COI 基因片段的堿基組成

對這3 個不同地理群體的30 個光滑河藍蛤的COI 基因片段進行分析，檢測到31 個多態(tài)性位點，32 個變異位點，其中包括19 個單一變異位點和13個簡約信息位點。轉(zhuǎn)換位點3 個，顛換位點1 個，7個插入/缺失位點。堿基轉(zhuǎn)換與顛換的平均比值R=2.77。共檢測到18 種單倍體型，3 個群體有一個共用單倍體型，東營群體和日照群體有2 個共用單倍體型，濰坊群體和日照群體有1 個共用單倍體型，其余單倍體型均為每個群體獨有，單倍體型及其在3 個群體中的分布如表2 所示。

表2 COI 基因單倍體型片段序列及變異位點

2.2 光滑河藍蛤群體多樣性分析

利用DNAsp4.0 計算群體內(nèi)遺傳多樣性參數(shù)，結(jié)果如表3 所示。3 個群體的COI 基因片段核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）為0.006 01，單倍體多態(tài)性（Hd）為0.890。由基于COI 基因片段可以看出，東營群體核苷酸多樣性指數(shù)最高，為0.007 36，東營群體單倍體多態(tài)性最高，為0.934，濰坊群體核苷酸多樣性指數(shù)最低，為0.004 46，濰坊群體的單倍體多態(tài)性最低，為0.867。

表3 光滑河藍蛤COI 遺傳多樣性參數(shù)比較

對群體間的遺傳多樣性指數(shù)進行分析，如表4所示，群體間COI 的平均核苷酸差異數(shù)（K）在3.450～4.380 之間，最低值3.450 出現(xiàn)在濰坊與日照群體之間，而最高值則出現(xiàn)在東營與日照群體之間。根據(jù)群體間的平均遺傳距離（D），東營群體和日照群體之間的平均遺傳距離最大，濰坊群體和日照群體之間的平均遺傳距離最小，在3 個群體中日照群體的核苷酸差異數(shù)最高。

表4 光滑河藍蛤群體間平均核苷酸差異數(shù)（K）和平均遺傳距離（D）

基因流（Nm）及遺傳分化系數(shù)（Fst）如表5 所示，數(shù)據(jù)顯示遺傳分化系數(shù)最高出現(xiàn)在東營與濰坊群體之間，基因流最大出現(xiàn)在日照與濰坊群體之間，但是基因流小于1，說明兩個群體之間雖然有基因交流但是非常少。如表6 所示，群體間平均每位點核苷酸代替數(shù)（Dxy）最大出現(xiàn)在東營群體和日照群體之間，群體間每位點凈核苷酸代替數(shù)（Da）最小值出現(xiàn)在東營群體和日照群體之間，且為負值，說明東營群體遺傳背景在3 個群體中較豐富，群體間的分化很少。

表5 基因流（Nm）和遺傳分化系數(shù)（Fst）

表6 光滑河藍蛤群體間遺傳差異比較

構(gòu)建基于COI 基因片段的系統(tǒng)發(fā)生NJ 樹（圖1）和UPGMA 樹（圖2），2 種進化樹拓撲結(jié)構(gòu)相似，顯示出3 個群體之間的個體聚合在一起，沒有出現(xiàn)群體內(nèi)個體首先聚在一起的情況。

圖1 3 個群體光滑河藍蛤線粒體COI 基因片段的NJ 樹

圖2 3 個群體光滑河藍蛤線粒體COI 基因片段的UPGMA 樹

3 討論與結(jié)論

細胞色素氧化酶（COI）基因進化速度快，是分析和檢測群體遺傳變異的一種有效的分子標記，在魚類[6]、蝦蟹類等[7-9]動物中都有應(yīng)用。該研究對3個群體光滑河藍蛤COI 基因進行PCR 擴增測序，得到665 bp 目的片段，A+T 含量明顯高于G+C 含量，這與牛東紅[10]、劉亞軍[11]、蘇天鳳[12]等研究中的A＋T 含量高于G＋C 含量的結(jié)果一致。COI 基因30條序列中共檢測到變異位點32 個，構(gòu)成18 種單倍體型，單倍體型多態(tài)性為0.890，低于牛東紅等[10]所研究的浙閩沿海?？O蟶（0.098 6）?；贑OI 基因部分片段分析，3 個群體中有1 個共有單倍體型，除此以外，東營群體與日照群體有2 個共用單倍體型，濰坊群體和日照群體有1 個共用單倍體型，其他單倍體型均為每個群體所獨有，這說明3 個群體都有各自的遺傳優(yōu)勢。COI 基因核苷酸多樣性指數(shù)東營群體最高，為0.007 36，日照群體的核苷酸多樣性指數(shù)為0.006 45，這2 個群體的核苷酸多樣性指數(shù)均低于縊蟶0.008 7[10]，高于長蛸0.005 72[13]，濰坊群體的核苷酸多樣性指數(shù)最低，為0.004 46。東營群體核苷酸多樣性指數(shù)較高，這可能是由于其樣品采于自然保護區(qū)內(nèi)，光滑河藍蛤棲息地人為保護較好，沒有遭到人為破壞，種群發(fā)展比較穩(wěn)定，積累的變異較多。濰坊群體取樣地點有捕撈船在當?shù)卮罅坎刹豆饣铀{蛤，種群在一定程度上遭到了破壞，沒有足夠時間積累核苷酸變異，因此核苷酸多樣性指數(shù)較低，野生光滑河藍蛤資源數(shù)量減少，遺傳多樣性水平降低。

Fst 值可以表示群體間的遺傳分化程度，F(xiàn)st 值在0～0.05 之間，表示分化較弱，在0.25 以上表示遺傳分化極大。該研究中3 個群體之間的遺傳分化較弱。通過2 種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示的拓撲結(jié)構(gòu)是一致的，不同群體的個體聚在一起，沒有出現(xiàn)明顯的同一群體首先聚類的情況。從地理位置上來看，東營和濰坊地理距離較近，而這2 個群體之間的基因流卻最小，遺傳分化最大。濰坊群體和日照群體之間的基因流最大，遺傳分化最小，分析其原因，可能是東營群體和濰坊群體雖然地理距離相對較近，但是都生活在封閉性較強的渤海，海水流動緩慢導致基因交流很少，從而產(chǎn)生了相對較大的遺傳分化。日照地區(qū)蝦蟹養(yǎng)殖比較多，做為蝦蟹可口餌料的光滑河藍蛤在濰坊海域被大量捕撈后運到日照地區(qū)，造成了一定程度上小范圍內(nèi)的基因交流，因此濰坊群體和日照群體之間的遺傳分化比東營地區(qū)的遺傳分化要小。孟學平等[14]在研究西施舌5 個地理群體間遺傳分化也遇到了類似問題，廣西北海群體與黃海的3 個群體遺傳分化很弱，這也說明地理位置不是決定遺傳分化程度的決定性因素。

研究中發(fā)現(xiàn)3 個群體的光滑河藍蛤存在一定的遺傳差異，但群體遺傳多樣性較小。因此，要提高檢測的遺傳多樣性的水平，應(yīng)再選擇核DNA 和線粒體DNA 其他的基因區(qū)域，如16S rRNA、COⅡ等基因得到多組序列數(shù)據(jù)等，從而更全面地分析光滑河藍蛤群體遺傳水平。

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