饒利華，吳芝瑛，徐 駿，陳 琳，張 巍，陳 鋆

(1:杭州市西湖水域管理處，杭州310002)

(2:杭州西湖風(fēng)景名勝區(qū)環(huán)境監(jiān)測站，杭州310008)

杭州西湖是世界文化遺產(chǎn)地之一，現(xiàn)有湖泊水域面積6.5 km2，平均水深2.7 m.關(guān)于西湖浮游動物的研究屢見報道［1-2］.李共國等［3］曾對引水和疏浚工程對西湖輪蟲群落結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明引水沖污對西湖表層的浮游輪蟲有明顯的稀釋作用，然而隨著引水量的急劇下降及疏浚工程激活的底泥營養(yǎng)的增加，導(dǎo)致輪蟲的密度和生物量增加.2003年，西湖引水工程由原來的直接引錢塘江水改造成在引水線上先進(jìn)行水質(zhì)預(yù)處理，這在很大程度上避免了錢塘江水質(zhì)對西湖水體生態(tài)系統(tǒng)的影響，也使年引水量保持平穩(wěn)的水平.

輪蟲是淡水浮游動物的重要組成部分之一.由于輪蟲個體較小、發(fā)育時間短、周轉(zhuǎn)快，生產(chǎn)量高以及對環(huán)境反應(yīng)靈敏，所以它在水生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能和生物生產(chǎn)力中具有重要意義.掌握輪蟲群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律是了解水域生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的重要內(nèi)容之一.同時輪蟲是良好的環(huán)境指示生物，輪蟲群落的生態(tài)特性可以作為水質(zhì)生物評價的依據(jù)［4-6］.輪蟲群落結(jié)構(gòu)的變化能夠及時反映水體環(huán)境狀況.因此，對輪蟲群落結(jié)構(gòu)及其與水體營養(yǎng)狀況關(guān)系進(jìn)行研究具有重要意義.本文對2007-2010年西湖輪蟲的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，分析西湖輪蟲的群落結(jié)構(gòu)和水體營養(yǎng)狀況，為引水改造工程后西湖富營養(yǎng)化評價提供基礎(chǔ)資料和生物學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 調(diào)查方法

從2007年1月到2010年10月，在1、4、7和10月份采樣1次.采樣和計數(shù)的方法:定性樣品用25#篩絹網(wǎng)拖網(wǎng)采集，定量樣品于湖面表層0.5 m處用2.5 L采樣器采集水樣10 L(部分點位鑒于密度極小，而將采樣量定為20 L)，現(xiàn)場用魯哥氏液固定，帶回實驗室沉淀36 h后濃縮至30 ml，以備鏡檢.采集生物樣品的同時采集水化學(xué)樣品.輪蟲的種類鑒定參考《中國淡水輪蟲志》［7］和《淡水生物圖譜》［8］.

溫度(T)、pH值在采樣現(xiàn)場測定;透明度(SD)采用塞氏盤測定;總氮(TN)采用堿性過硫酸鉀硝解紫外分光光度法測定;銨態(tài)氮采用納氏試劑比色法測定;硝態(tài)氮采用離子色譜法測定;總磷(TP)采用鉬銻抗分光光度法測定;高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)采用酸性高錳酸鉀法測定;葉綠素a(Chl.a)采用丙酮提取分光光度法測定［9］.

1.2 采樣點的設(shè)置

本研究在西湖共設(shè)置了9個采樣點(圖1).西湖引水工程的進(jìn)水口設(shè)在小南湖，出水口設(shè)在少年宮，即小南湖、外湖和少年宮3個點位正好處于引水水流的中軸線上.

圖1 西湖采樣點位示意圖Fig.1 Location of sampling sites in West Lake

1.3 數(shù)據(jù)處理

輪蟲的生物多樣性采用Margalef多樣性指數(shù)(d)和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H')，公式分別為:

式中，S為種類數(shù)，Pi為某種輪蟲的密度占總個體密度(ind./L)的比例，N為輪蟲的密度(ind./L).

綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)計算公式為［10］:

式中，TLI(∑)為綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù);Wj為第j種參數(shù)的營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)的相關(guān)權(quán)重;TLI(j)代表第j種參數(shù)的營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù).

幾種參數(shù)的營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)計算公式為:

式中，Chl.a單位為mg/m3，SD單位為m;其他指標(biāo)單位均為mg/L.

Wj的計算以葉綠素a為基準(zhǔn)，其公式為:Wj=rij2/∑rij2，rij表示第 j種參數(shù)與基準(zhǔn)參數(shù)Chl.a的相關(guān)系數(shù)，i=1～m(m為評價參數(shù)的個數(shù)).根據(jù)金相燦等的《中國湖泊環(huán)境》［10］，中國 26 個主要湖泊的 rij見表 1.本文亦以此作為參考.

表1 中國湖泊(水庫)部分參數(shù)與Chl.a的相關(guān)系數(shù)rij及r2ij值Tab.1 The correlation coefficient(rij)between chlorophyll-a and other parameters in Chinese lakes

湖泊水體營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)采用0～100的一系列連續(xù)數(shù)字進(jìn)行分級，具體如下:TLI(∑)＜30時為貧營養(yǎng);30≤TLI(∑)≤50時為中營養(yǎng);TLI(∑)＞50時為富營養(yǎng);50＜TLI(∑)≤60時為輕度富營養(yǎng);60＜TLI(∑)≤70時為中度富營養(yǎng);TLI(∑)＞70時為重度富營養(yǎng).

2 結(jié)果與分析

2.1 西湖營養(yǎng)狀況評價

西湖少年宮、外湖、北里湖等點位pH、總磷、高錳酸鹽指數(shù)、葉綠素a高于其他點位，標(biāo)準(zhǔn)偏差也相對較大.而總氮、硝態(tài)氮則是金沙港、茅家埠、烏龜潭、浴鵠灣、小南湖等點位明顯高于其他點位(圖2)，這與西湖湖西水域常年接收氮含量高的錢塘江引水有關(guān).從綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)來看，西湖總體處于中-富營養(yǎng)狀態(tài)，最大值出現(xiàn)在2009年7月份的少年宮，為62.7(表2).從TLI年均值來看，最大值出現(xiàn)在2010年的少年宮，為55.2;最小值出現(xiàn)在2007年的烏龜潭，為35.8.

圖2 調(diào)查期間西湖各點位的水質(zhì)特征Fig.2 The characteristics of water quality of each sampling site in West Lake during the research

表2 西湖各點位綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)Tab.2 The TLI index of each sampling site in West Lake

2.2 西湖輪蟲的群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 種類組成 調(diào)查期間共檢到輪蟲29種，常見種有針簇多肢輪蟲、邁氏三肢輪蟲、萼花臂尾輪蟲、角突臂尾輪蟲、裂足臂尾輪蟲、螺形龜甲輪蟲、前節(jié)晶囊輪蟲等.調(diào)查期間，角突臂尾輪蟲和螺形龜甲輪蟲在所有采樣點位均出現(xiàn)，是西湖最常見的2個種.從調(diào)查結(jié)果來看，西湖輪蟲優(yōu)勢種為針簇多肢輪蟲、萼花臂尾輪蟲、角突臂尾輪蟲和螺形龜甲輪蟲等(表3).

表3 西湖輪蟲的種類組成Tab.3 Species composition of rotifers in West Lake

2.2.2數(shù)量變化 西湖輪蟲的數(shù)量整體處于較低的水平.按每季度每點位采樣一次作為一個頻次，四年調(diào)查期間，總采樣頻次約為108.而輪蟲總密度超過500 ind./L的為15頻次，占總采樣頻次的13.9%;輪蟲總密度超過1000 ind./L的為5頻次，占總采樣頻次的4.6%;輪蟲總密度不超過10 ind./L的為8頻次，占總采樣頻次的7.4%.調(diào)查期間，西湖輪蟲密度最大值為2247 ind./L，出現(xiàn)在2009年秋季的少年宮，優(yōu)勢種為螺形龜甲輪蟲(1599 ind./L)和針簇多肢輪蟲(519 ind./L);而2008年秋季和冬季的小南湖，20 L水樣經(jīng)濃縮后幾乎鏡檢不到輪蟲.

從季節(jié)變化來看，各采樣點在不同年份表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律.以北里湖為例，2008年最高密度出現(xiàn)在春季，為969 ind./L，最低密度出現(xiàn)在冬季，為40.5 ind./L;2009年最高密度出現(xiàn)在秋季，為1728 ind./L，最低密度出現(xiàn)在冬季，為42 ind./L;而到了2010年最高密度又出現(xiàn)在夏季，為1273.5 ind./L(圖3).相關(guān)性分析結(jié)果表明，西湖輪蟲密度不僅與水溫的相關(guān)性(r=0.274，P＜0.01)高度顯著，而且與TLI指數(shù)、總氮、高錳酸鹽指數(shù)、透明度和 pH 值的相關(guān)性也高度顯著(rTLI指數(shù)=0.351，rTN= －0.348，rCODMn=0.338，rSD=－0.442，rpH=0.318;P＜0.01).說明西湖輪蟲密度的季節(jié)變化不僅與水溫、餌料等季節(jié)因素有關(guān)，還與受西湖引水影響較大的總氮、高錳酸鹽指數(shù)、透明度等其他因素有關(guān).輪蟲群落結(jié)構(gòu)年度季節(jié)動態(tài)規(guī)律變化不一，反映了西湖整體生態(tài)環(huán)境受引水等外部環(huán)境影響較大，生態(tài)系統(tǒng)還比較脆弱.

圖3 調(diào)查期間北里湖輪蟲密度的季節(jié)分布Fig.3 The seasonal distribution of rotifer density of North West Lake during the research

2.2.3 多樣性指數(shù) 西湖輪蟲的Margalef多樣性指數(shù)年均值最大為2.16，最小為0.81;Shannon-Wiener多樣性指數(shù)年均值最大為2.45，最小為1.27.不同點位Margalef多樣性指數(shù)和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)存在差異(圖4).Margalef多樣性指數(shù)和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)與TLI指數(shù)及其他水質(zhì)指標(biāo)表現(xiàn)出不同的相關(guān)性.Margalef多樣性指數(shù)只與總氮有顯著的相關(guān)性(r=－0.225，P＜0.05)，而與水溫、透明度、總磷、高錳酸鹽指數(shù)、Chl.a、pH及TLI指數(shù)的相關(guān)性不顯著;Shannon-Wiener多樣性指數(shù)與總磷、高錳酸鹽指數(shù)相關(guān)性顯著(rTP=0.212，rCODMn=0.237;P ＜0.05)，與水溫、透明度、Chl.a、pH 及 TLI指數(shù)的相關(guān)性高度顯著(rT=0.386，rSD= －0.304，rChl.a=0.387，rpH=0.373，rTLI指數(shù)=0.338;P ＜0.01).

2.2.4 水體環(huán)境因子與輪蟲群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系 輪蟲密度與溫度、高錳酸鹽指數(shù)以及pH值呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系;與透明度、總氮呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系;與總磷、葉綠素a相關(guān)性不顯著.輪蟲種類數(shù)與溫度、高錳酸鹽指數(shù)、總磷、葉綠素a、pH值均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系;與透明度、總氮呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(表4).

圖4 西湖輪蟲的物種多樣性指數(shù)Fig.4 Shannon-Wiener diversity index and Margalef diversity index of rotifer community in West Lake

表4 水體環(huán)境因子與輪蟲群落結(jié)構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果Tab.4 The results of correlation analysis between environmental factors of the water and index of rotifer community structure

3 討論

杭州西湖輪蟲群落結(jié)構(gòu)季節(jié)變化明顯，但每年的規(guī)律卻不盡相同.水溫被認(rèn)為是影響輪蟲種類季節(jié)變化最主要的環(huán)境因子［11］.Hofmann［12］認(rèn)為水溫是影響輪蟲變化的主要但并非唯一決定性因素.Nagata等［13］認(rèn)為水溫、pH值和溶解氧是影響輪蟲現(xiàn)存量、現(xiàn)存種類和密度動態(tài)的主要生態(tài)因子.在不同水體中，任何一個因素的差異都可能導(dǎo)致現(xiàn)存輪蟲群落結(jié)構(gòu)不同，進(jìn)而導(dǎo)致研究結(jié)果出現(xiàn)差異.章宗涉等［14］對武漢東湖長期的調(diào)查研究表明，輪蟲密度高峰期時水溫一般在20℃以上，原因是溫度上升，卵的發(fā)育時間縮短，在豐富的食物供給條件下，使種群周轉(zhuǎn)加快，導(dǎo)致種群密度迅速增加，從而形成密度高峰.杭州西湖的輪蟲密度與水溫的相關(guān)性高度顯著(r=0.274，P＜0.01)，但卻并不是唯一的決定性因素.而且，在幾個相關(guān)性高度顯著的指標(biāo)中，水溫的相關(guān)系數(shù)最低(rSD＞rTLI指數(shù)＞rTN＞rCODMn＞rpH＞rT).杭州西湖透明度與輪蟲密度顯著負(fù)相關(guān)(r=－0.442，P＜0.01)，這與孔令惠等的研究結(jié)果一致［15］.營養(yǎng)鹽在影響浮游植物生產(chǎn)的同時也會對浮游動物多樣性和數(shù)量產(chǎn)生一定影響，但這種影響作用通常是間接的，浮游動物的種類和數(shù)量與營養(yǎng)鹽密切相關(guān)［15］.東湖浮游動物物種多樣性與營養(yǎng)水平呈現(xiàn)相反的趨勢，即當(dāng)水體中營養(yǎng)型向富營養(yǎng)型過渡時物種多樣性降低，但浮游動物的密度與生物量卻增高［16-17］;太湖三個湖區(qū)具有不同的水體營養(yǎng)水平，同時其輪蟲群落結(jié)構(gòu)也不同［18］.杭州西湖氮、磷兩大主要營養(yǎng)元素與輪蟲密度呈現(xiàn)不同的相關(guān)性.輪蟲密度與總氮的相關(guān)性高度顯著(r= －0.348，P ＜0.01)，而與總磷相關(guān)性不顯著(r=0.173，P ＞0.05).陳立婧等［19］對上海崇明島明珠湖輪蟲群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果表明明珠湖輪蟲生物密度與葉綠素a含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系.而杭州西湖輪蟲生物密度與Chl.a相關(guān)性并不顯著(r=0.153，P＞0.05)，這可能與西湖Chl.a受引水稀釋影響常年處于較低的水平且水平分布不平衡有關(guān).

多樣性指數(shù)能定量反映輪蟲群落結(jié)構(gòu)中數(shù)量、種類組成變化的信息及水體污染程度，間接反映水體輪蟲群落結(jié)構(gòu)的特點［20-21］.然而，多樣性指數(shù)與水體營養(yǎng)類型之間關(guān)系存在不穩(wěn)定性，與水質(zhì)的關(guān)系也相當(dāng)復(fù)雜，與水體類型、水力學(xué)特征、種類鑒定的詳細(xì)程度等多種因素相關(guān)［22］.謝平等認(rèn)為營養(yǎng)水平并不是影響物種多樣性的唯一因素，可能與其他生物和非生物因子的不同有一定關(guān)系［17］.本文通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Margalef多樣性指數(shù)和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)與TLI指數(shù)及其他水質(zhì)指標(biāo)表現(xiàn)出不同的相關(guān)性.Margalef多樣性指數(shù)只與總氮有顯著的相關(guān)性，而與水溫、透明度、總磷、高錳酸鹽指數(shù)、Chl.a、pH及TLI指數(shù)的相關(guān)性不顯著;Shannon-Wiener多樣性指數(shù)與總磷、高錳酸鹽指數(shù)相關(guān)性顯著，與水溫、透明度、Chl.a、pH及TLI指數(shù)的相關(guān)性高度顯著.Margalef多樣性指數(shù)和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)與輪蟲密度的相關(guān)性不顯著(rMargalef= －0.083，rShannon-Wiener=0.023;P ＞0.05)，而與種類數(shù)之間相關(guān)性均高度顯著(rMargalef= －0.689，rShannon-Wiener=0.700;P ＜0.01).

輪蟲發(fā)育快、周期短，能迅速地反應(yīng)環(huán)境的變化，被認(rèn)為是水質(zhì)和環(huán)境良好的指示生物［23-26］.一般認(rèn)為，隨著水體營養(yǎng)水平的上升，輪蟲的種類和數(shù)量有逐漸增加的趨勢.相關(guān)分析結(jié)果表明，西湖輪蟲密度與綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)存在高度顯著的相關(guān)性(r=0.351，P＜0.01).然而，杭州西湖作為城市淺水型湖泊，多年來一直施行引水工程，水力滯留時間相對較短.因此，西湖輪蟲群落結(jié)構(gòu)及其與水體理化、生物因子的關(guān)系和其他湖泊的研究結(jié)果存在一定的差異［15，27］.小南湖站點(引水入湖口)輪蟲密度常年處于一個較低的水平，多樣性水平低，季節(jié)變化不明顯;少年宮站點(出水口)多樣性水平較高，季節(jié)變化明顯.從引水入湖口到出水口存在一個由水動力學(xué)過程為主導(dǎo)的生態(tài)梯度［15］(圖5).西湖輪蟲密度不僅取決于水溫、營養(yǎng)鹽含量等因素，還受引水過程引起的水動力學(xué)的影響.

4 結(jié)論

1)西湖綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)年均值介于35.8～55.2之間，西湖總體處于中-富營養(yǎng)狀態(tài);

2)西湖輪蟲數(shù)量上整體處于較低的水平，多樣性水平不高;以角突臂尾輪蟲、螺形龜甲輪蟲最為常見;各采樣點在不同年份表現(xiàn)出不同的季節(jié)變化規(guī)律;

3)相關(guān)性分析結(jié)果表明，西湖輪蟲密度與水溫、TLI指數(shù)、總氮、高錳酸鹽指數(shù)、透明度和pH值的相關(guān)性高度顯著(P＜0.01);

4)Margalef多樣性指數(shù)和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)與水體環(huán)境因子表現(xiàn)出不同的相關(guān)性，前者相關(guān)性不顯著(除總氮外)，后者相關(guān)性高度顯著;

5)西湖輪蟲結(jié)構(gòu)受引水過程引起的水動力學(xué)的影響，從引水入湖口到出水口存在一個由水動力學(xué)過程為主導(dǎo)的生態(tài)梯度.

圖5 西湖引水形成的生態(tài)梯度示意圖:(a)引水的流向;(b)TLI指數(shù)隨引水水流逐漸增大的梯度變化;(c)輪蟲密度隨引水水流逐漸增大的梯度變化;(d)輪蟲種類數(shù)隨引水水流逐漸增多的梯度變化(TLI指數(shù)和輪蟲密度為年度平均值;輪蟲種類數(shù)為周年四次采樣鏡檢所觀察到的全部種類;圖c、圖d所示并不是表示每次檢測結(jié)果均符合這種變化)Fig.5 The ecological gradient of rotifer caused by waterflow in West Lake:(a)the water flow;(b)the gradient of TLI index;(c)the gradient of rotifer density;(d)the gradient of rotifer species

［1]魏崇德，俞大維.杭州西湖浮游動物的研究.杭州大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，1983，10(增刊):1-17.

［2]李共國，魏崇德，裴洪平.引水對杭州西湖輪蟲群落結(jié)構(gòu)的影響.動物學(xué)雜志，1998，33(5):1-4.

［3]李共國，吳芝瑛，虞左明.引水和疏浚工程對杭州西湖輪蟲群落結(jié)構(gòu)的影響.水生生物學(xué)報，2007，31(3):386-392.

［5]M?emets A.Rotifers as indicators of lake types in Estonia.Hydrobiologia，1983，104:357-361.

［6]Devetter M.Influence of environmental factors on the rotifer assemblages in an artificial lake.Hydrobiologia，1998，387/388:171-178.

［7]王家輯.中國淡水輪蟲志.北京:科學(xué)出版社，1961:21-283.

［8]韓茂森，束蘊(yùn)芳.淡水生物圖譜.北京:海洋出版社，1995:192-219.

［9]《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法:第4版.北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002.

［10]金相燦，劉樹坤，章宗涉.中國湖泊環(huán)境.北京:海洋出版社，1995.

［11]May L.Rotifer occurrance in relation to water temperature in Loch Leven，Scoland.Hydrobiologia，1983，104:311-315.

［12]Hofmann W.The influence of abiotic environmental factors on population dynamics in planktonic rotifers.Arch Hydrobiol Beih，1977，8:77-83.

［13]Nagata T，Hanazato T.Different predation impacts of two cyclopoid species on a small-sized zooplankton community:an experimental analysis with mesocosms.Hydrobiologia，2006，556:233-242.

［14]章宗涉，黃祥飛.淡水浮游生物研究方法.北京:科學(xué)出版社，1991:232-252.

［15]孔令惠，蔡慶華，徐耀陽等.丹江口水庫浮游輪蟲群落季節(jié)變動特征及其與環(huán)境因子的關(guān)系.湖泊科學(xué)，2010，22(6):941-949.

［16]黃祥飛，陳雪梅，伍悼田等.武漢東湖浮游動物數(shù)量和生物量變動的研究.水生生物學(xué)集刊，1984，8(3):345-358.

［17]謝 平，諸葛燕，戴 莽等.水體富營養(yǎng)化對浮游動物群落多樣性的影響.水生生物學(xué)報，1996，20(增刊):30-37.

［18]楊桂軍，潘宏凱，劉正文等.太湖不同富營養(yǎng)水平湖區(qū)輪蟲季節(jié)變化的比較.湖泊科學(xué)，2007，19(6):652-657.

［19]陳立婧，顧 靜，彭自然等.上海崇明島明珠湖輪蟲群落結(jié)構(gòu).應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2009，20(12):3057-3062.

［20]M?emets A.Rotifers as indicators of lake types in Estonia.Hydrobiologia，1983，104:357-361.

［21]黃祥飛，胡春英，伍焯田.武昌東湖的輪蟲.水生生物學(xué)報，1985，9(2):129-142.

［22]雷安平，施之新，魏印心.武漢東湖浮游藻類物種多樣性的研究.水生生物學(xué)報，2003，27(2):179-184.

［23]楊 柳，陳綿潤，林秋奇等.一座熱帶高產(chǎn)漁業(yè)水庫枯水期輪蟲的群落組成與動態(tài)分析.湖泊科學(xué)，2008，20(6):780-789.

［24]周淑嬋，黃祥飛，唐 濤等.香溪河庫灣輪蟲現(xiàn)狀及水質(zhì)評價初探.水生生物學(xué)報，2006，30(1):52-57.

［25]胡菊香，鄭金秀，趙先富等.長江上游輪蟲群落縱向演替研究.水生態(tài)學(xué)雜志，2009，2(2):94-100.

［26]林秋奇，趙帥營，韓博平.廣東省水庫輪蟲分布特征.生態(tài)學(xué)報，2005，25(5):1123-1131.

［27]郭 凱，趙 文，殷守仁等.北京官廳水庫輪蟲群落結(jié)構(gòu)與水體富營養(yǎng)化狀況.湖泊科學(xué)，2010，22(2):256-264.