李雪燕，安方玉，李世功，陳開兵，張麗云

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000;2.甘肅省武威腫瘤醫(yī)院，甘肅 武威733000;3.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，甘肅蘭州730020)

癡呆綜合征是中老年常見病，目前尚無理想治療方案，因而早期發(fā)現(xiàn)、及時(shí)防治成為醫(yī)學(xué)界的研究焦點(diǎn)。由于西藥療效不盡人意，而且多數(shù)價(jià)格較昂貴，所以從單味中藥提取有效成分用于及早防治成為該領(lǐng)域研究的重要組成部分。大量研究證實(shí):中藥多糖確有明顯的延緩衰老的作用［1－4］。當(dāng)歸多糖是甘肅道地藥材當(dāng)歸的有效成分之一，已有文獻(xiàn)［5］報(bào)道:當(dāng)歸多糖具有抗腫瘤、延緩衰老、治療老年癡呆等作用，但是其延緩衰老和治療老年癡呆的確切機(jī)制尚未明確，因此本研究觀察老年癡呆小鼠小鼠腦組織 Ca2+濃度、Ca2+-ATPase、Ca2+Mg2+-ATPase和AchE活性的變化，以期揭示當(dāng)歸多糖抗衰老和治療老年癡呆的作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng) 物

清潔級昆明種小鼠72只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號:SCXK(甘)2011－0001－0001126。

1.2 藥品、試劑與儀器

當(dāng)歸多糖，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號CY110320，用生理鹽水配制成10 g/L的儲(chǔ)備液以備用。D－半乳糖，北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，批號020123，臨用前用生理鹽水配制成12 g/L液體備用;亞硝酸鈉，西安化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，批號860723，臨用前用生理鹽水配制成9 g/L液體備用。鈣測定試劑盒(批號20111023)、Ca2+-ATPase試劑盒(批號20110817)、Ca2+Mg2+-ATPase 試 劑 盒 (批 號20110810)、AchE試劑盒(批號20110720)及考馬斯亮藍(lán)測定試劑盒(批號20110716)，均由南京建成生物工程研究所提供。SK3300H型數(shù)控超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品;VIS-723N型紫外可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司產(chǎn)品;BS224S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，鄭州杜甫儀器廠產(chǎn)品;XYJ80-20型離心機(jī)，金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品;XW-80A型旋渦混勻器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品;ZY12306型微量加樣器，Scientific產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組、給藥與模型的建立

將小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型對照組、腦復(fù)康組及當(dāng)歸多糖低、中、高劑量組共6組，每組12只。除空白對照組外，其余各組每日腹腔注射 D －半乳糖120 μg/g 和亞硝酸鈉90 μg/g［6－7］，聯(lián)合給藥制備老年癡呆小鼠模型;空白對照組腹腔注射等體積的生理鹽水，連續(xù)30 d。30 d后，腹腔注射同時(shí)，腦復(fù)康組灌胃給腦復(fù)康200 μg/g，當(dāng)歸多糖高、中、低劑量組則依次灌胃給當(dāng)歸多糖400，200和100 μg/g;模型對照組及空白對照組灌服等體積的生理鹽水，連續(xù)6周。斷頭處死小鼠，取大腦用冷生理鹽水沖洗，剝?nèi)〈竽X組織，用生理鹽水制成100 g/L腦勻漿，3000 rpm/min低溫離心10 min，取上清液備用。

1.4 檢測指標(biāo)

定磷法分別比色測定 Ca2+濃度及Ca2+-ATPase、Ca2+Mg2+-ATPase活性;對稱三硝基苯(TNB)比色測定AchE活性;考馬斯亮藍(lán)檢測蛋白定量。檢測步驟嚴(yán)格遵照試劑盒說明書。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)()±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腦組織 Ca2+濃度、Ca2+-ATPase及Ca2+Mg2+-ATPase活性對比

與空白對照組對比，模型對照組小鼠腦組織Ca2+濃度升高，Ca2+-ATPase及 Ca2+Mg2+-ATPase活性下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型對照組對比，當(dāng)歸多糖各劑量組腦組織Ca2+濃度降低，Ca2+-ATPase及Ca2+Mg2+-ATPase活性增高，尤其中、高劑量組Ca2+Mg2+-ATPase活性提高更為明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);與腦復(fù)康組對比，高劑量組較之差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腦組織Ca2+濃度、Ca2+-ATPase及Ca2+Mg2+-ATPase活性對比n=12，±s

表1 各組小鼠腦組織Ca2+濃度、Ca2+-ATPase及Ca2+Mg2+-ATPase活性對比n=12，±s

注:與空白對照組對比，*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01;與模型對照組對比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與腦復(fù)康組對比，△ P ＜0.05。

組 別 劑量/(μg·g－1) Ca2+/(mmol·gprot－1) Ca2+-ATPase/(U·mgprot－1) Ca2+Mg2+-ATPase/(U·mgprot－1)2.27 ±0.97 3.23 ±1.08 25.94 ±8.34模型對照組 0 4.58±1.09＊＊ 1.66±1.09＊＊ 13.95±2.82＊＊腦復(fù)康組 200 2.87 ±1.09* 2.96 ±1.16# 20.83 ±6.19#當(dāng)歸多糖低劑量組 100 3.03 ±1.20* 2.83 ±1.03# 19.46 ±4.87#當(dāng)歸多糖中劑量組 200 2.19±1.27＊＊ 3.35±1.90## 25.88±7.92##當(dāng)歸多糖高劑量組 400 1.63±1.02##△ 4.23±1.99##△ 29.32±7.56##△空白對照組0

2.2 各組小鼠腦組織AchE活性對比

與空白對照組對比，模型對照組小鼠腦組織AchE活性升高(P＜0.01)。與模型對照組對比，當(dāng)歸多糖各劑量組AchE活性降低(P＜0.05或P＜0.01);與腦復(fù)康組對比，僅高劑量組較之差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腦組織AchE活性對比n=12，±s

表2 各組小鼠腦組織AchE活性對比n=12，±s

注:與空白對照組對比，*P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與模型對照組對比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與腦復(fù)康組對比，△ P ＜0.05。

組 別 劑量/(μg·g－1) AchE/(U·mL－1)25.45 ±7.82模型對照組 0 45.53 ±5.99＊＊腦復(fù)康組 200 35.71 ±3.45#當(dāng)歸多糖低劑量組 100 35.90 ±13.69#當(dāng)歸多糖中劑量組 200 29.31 ±21.76##當(dāng)歸多糖高劑量組 400 24.77 ±10.34##△空白對照組0

3 討論

老年性癡呆是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶能力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病。目前有關(guān)癡呆的學(xué)說很多，如鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、膽堿能神經(jīng)損害、自由基損傷、基因突變、能量代謝障礙、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、淀粉樣蛋白(Aβ)沉積等［8］。鈣穩(wěn)態(tài)失衡學(xué)說認(rèn)為:鈣在神經(jīng)元的發(fā)育、突觸間傳遞、神經(jīng)可塑性、各種代謝通道的調(diào)節(jié)中承擔(dān)著信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重任。但是隨著細(xì)胞老化，細(xì)胞內(nèi)能量代謝水平下降，維持細(xì)胞膜電位所必需的三磷酸腺苷依賴性膜運(yùn)輸減少，使離子通道受損，進(jìn)而引起一系列的可能在老年癡呆發(fā)病中起作用的變化Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)受到影響，Ca2+緩慢持續(xù)內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi) Ca2+水平增高，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)鈣過負(fù)荷。膽堿能神經(jīng)損傷學(xué)說則認(rèn)為:老年癡呆者海馬及額葉的膽堿能神經(jīng)元易受損害使乙酰膽堿產(chǎn)生缺陷。膽堿能神經(jīng)元發(fā)生損害后，可能會(huì)引起突觸減少甚至喪失，引起認(rèn)知、記憶等多方面的功能障礙。腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的退變被認(rèn)為是造成AD的最重要病理因素之一［9］。在阿爾茨海默病患者腦中，基底前腦的膽堿神經(jīng)細(xì)胞明顯丟失，膽堿能神經(jīng)纖維退變，患者腦脊液和腦組織中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、AchE在腦內(nèi)的表達(dá)出現(xiàn)異常，乙酰膽堿的合成、釋放、攝取等功能亦下降。針對上述兩種學(xué)說，已有研究［10］證實(shí):當(dāng)歸可提高D－半乳糖所致老年癡呆模型小鼠腦細(xì)胞膜的Ca2+-ATPase的活性，提示當(dāng)歸通過增加Ca2+-ATPase活性而降低細(xì)胞鈣的含量;中藥多糖對老年癡呆模型小鼠膽堿能神經(jīng)損傷具有修復(fù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與空白對照組對比，D－半乳糖和亞硝酸鹽致老年癡呆小鼠模型的腦組織Ca2+含量和AchE活性升高、Ca2+-ATPase及Ca2+Mg2+-ATPase活性降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型對照組對比，當(dāng)歸多糖高劑量組腦組織Ca2+含量及 AchE活性降低，腦組織 Ca2+-ATPase、Ca2+Mg2+-ATPase活性提高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示:當(dāng)歸多糖抗老年癡呆的機(jī)理可能是通過改善腦細(xì)胞膜對Ca2+-ATPase及Ca2+Mg2+-ATPase的敏感性，恢復(fù)腦細(xì)胞膜正常的離子轉(zhuǎn)運(yùn)，使腦細(xì)胞代謝趨于正常;或者是通過改善中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能實(shí)現(xiàn)的。其相關(guān)基因和蛋白表達(dá)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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