汪園園，郝文波，羅樹紅

痘病毒為病毒顆粒中最大的一類DNA病毒，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，呈磚形或橢圓形，大小為（300～450）nm×170nm×260nm［1］。痘病毒編碼3種類型的基因：早期基因、中期基因和晚期基因［2］。痘病毒的基因組序列分析提供了痘病毒基因組的大量信息，發(fā)現(xiàn)了很多新的基因，部分基因編碼蛋白在痘病毒復(fù)制、感染、致病及傳播過(guò)程中具有關(guān)鍵作用，但這些基因的確切功能不明。近年來(lái)，各痘病毒蛋白之間以及痘病毒蛋白與宿主細(xì)胞蛋白之間的相互作用受到了廣泛的關(guān)注。利用現(xiàn)代分析生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)對(duì)病毒蛋白之間及病毒蛋白及宿主蛋白之間的相互作用的系統(tǒng)研究，為病毒與宿主相互作用的分子機(jī)制的闡明，及在此基礎(chǔ)上的痘病防控提供了理論基礎(chǔ)。其 中，酵 母 雙 雜 交 系 統(tǒng) （yeast two－h(huán)ybrid，Y2H）是研究蛋白質(zhì)之間相互作用的重要工具，該技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)新蛋白之間的相互作用，確定蛋白相互作用的區(qū)域，從而為研究各蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能以及蛋白質(zhì)之間相互作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本文綜述了酵母雙雜交系統(tǒng)在痘病毒蛋白之間及病毒－宿主相互作用的研究現(xiàn)狀。

1 酵母雙雜交系統(tǒng)

1．1 酵母雙雜交系統(tǒng)原理 1986年，巴斯德實(shí)驗(yàn)室［3］發(fā)現(xiàn)一種酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活化因子Gal4模塊，Gal4結(jié)合一個(gè)特殊的DNA序列：上游激活區(qū) （upstream activation domain，UAS），在半乳糖存在時(shí)會(huì)激活轉(zhuǎn)錄。Gal4模塊分為兩個(gè)不同功能區(qū)：N－末端區(qū)域可以結(jié)合UAS，為DNA結(jié)合區(qū)（Binding domain，BD）；C－末端區(qū)域在半乳糖存在時(shí)能激活轉(zhuǎn)錄，為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（Activation domain，AD）。兩個(gè)區(qū)域如果分開，各自均不具有轉(zhuǎn)錄活性，但如果兩個(gè)區(qū)域經(jīng)非共價(jià)鍵重新組合，Gal4又可恢復(fù)轉(zhuǎn)錄活性。Field和Song［4］受到此啟發(fā)，發(fā)明了酵母雙雜交系統(tǒng)。他們將已知基因（誘餌基因）構(gòu)建在含有BD的質(zhì)粒載體上，靶基因（捕獲基因或含有目的基因的cDNA文庫(kù)）構(gòu)建在含有AD質(zhì)粒載體上，共表達(dá)于酵母細(xì)胞中，如果BD結(jié)合的誘餌蛋白和AD結(jié)合的靶蛋白或文庫(kù)中某些cDNA編碼蛋白相互作用，則AD和BD在空間上接近，形成有完整功能的轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)下游報(bào)告基因的表達(dá)。經(jīng)典的酵母雙雜交系統(tǒng)由誘餌蛋白，靶蛋白（文庫(kù)蛋白）和帶報(bào)告基因及多種選擇標(biāo)記的酵母細(xì)胞組成。目前，經(jīng)典的酵母雙雜交系統(tǒng)已擴(kuò)展到利用不同的DNA－結(jié)合蛋白、誘餌蛋白［5－6］、轉(zhuǎn)錄激活因子［7］和不同的報(bào)告基因［8］（HIS3，ADE2，MEL1，AUR1－C）來(lái)篩選相互作用的蛋白，然后通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷及顏色反應(yīng)篩選出與誘餌蛋白相互作用的蛋白（圖1）。

圖1 酵母雙雜交系統(tǒng)基本原理Fig．1 The yeast two－h(huán)ybrid principle

圖2 酵母雙雜交系統(tǒng)的技術(shù)路線Fig．2 Technology roadmap of yeast two－h(huán)ybrid system

1．2 酵母雙雜交系統(tǒng)技術(shù)路線 利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選cDNA文庫(kù)，鑒定出與誘餌蛋白相互作用的蛋白為例，其技術(shù)流程為：①誘餌載體的構(gòu)建。將編碼誘餌蛋白的基因與誘餌載體pGBKT7相連接，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y2HGold中，經(jīng)毒性和自激活實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為陰性后，可用于篩選文庫(kù)；②構(gòu)建一定庫(kù)容量的cDNA文庫(kù)。將cDNA與質(zhì)粒pGADT7－Rec共轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y187中，cDNA序列整合到載體上，完成cDNA文庫(kù)的構(gòu)建；③篩選文庫(kù)。將含有誘餌蛋白載體（Y2Hgold）和靶蛋白載體（Y187）的酵母菌株融合后，在酵母細(xì)胞中表達(dá)BD－誘餌蛋白和AD－靶蛋白，若誘餌蛋白與靶蛋白有相互作用，則形成完整功能的轉(zhuǎn)錄激活因子，啟動(dòng)下游報(bào)告基因，通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)與否，篩選出相互作用的蛋白（圖2），然后進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

2 酵母雙雜交系統(tǒng)在研究痘病毒中的作用

2．1 痘病毒蛋白之間的相互作用 痘病毒生活周期復(fù)雜，且病毒編碼的蛋白之間存在相互作用（protein－protein interactions，PPIs）。有些蛋白可組裝成一個(gè)功能基團(tuán)，如牛痘病毒（vaccinia virus，VACV）蛋 白 質(zhì) 復(fù) 合 體 （entry－fusion complex，EFC）［9］。痘病毒蛋白之間的相互作用，參與許多重要的生化途徑，如蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化在痘病毒不同的生活周期中起不同作用。假如我們知道其中的一種蛋白參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、病毒結(jié)構(gòu)、逃避宿主免疫等活動(dòng)，就可以推測(cè)與其相互作用的未知蛋白的功能。Mccraith S［10］等采用酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)牛痘病毒編碼的蛋白之間的相互作用進(jìn)行研究。在酵母細(xì)胞中，表達(dá)226種牛痘病毒開放閱讀框（open reading frames ORFs），發(fā)現(xiàn)了37種特異性相互作用的蛋白，其中28種是先前未知的。可以將這些相互作用蛋白組分為5組，包括參與DNA復(fù)制、DNA轉(zhuǎn)錄、病毒結(jié)構(gòu)形態(tài)的形成，病毒－宿主之間的作用以及一些功能未知的作用組，由此也可以推測(cè)一些未知蛋白的作用。在牛痘病毒基因組編碼蛋白范圍內(nèi)篩選相互作用蛋白時(shí)，某些蛋白之間的相互作用揭示了一些我們以前沒(méi)有注意的蛋白質(zhì)，例 如，A2．5H 與 E1OR 之間 的 相 互 作 用［11］。Senkevich T G［11］證明 A2．5H 與 E1OR 在病毒的形態(tài)形成中有重要作用，還有一些蛋白在以往的研究中顯示相互作用，但是在酵母雙雜交系統(tǒng)中卻沒(méi)有檢測(cè)到［12］。Ishii K［13］在 Mccraith S的研究基礎(chǔ)上確定A20R與H5R、D5R、D4R存在相互作用，其中，A20R的氨基酸殘基1～25、26～76和201～251分別與D4R、H5R、D5R存在相互作用。Dellis［14］利用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)痘病毒具有調(diào)節(jié)痘病毒晚期基因表達(dá)的蛋白A1L、A2L、G8R與H5R蛋白之間的相互作用，結(jié)果驗(yàn)證了G8R與自身及A1L的相互作用，并且觀察到A1L和H5R的自身相互作用及A2L與 G8R，A2L與 H5R，H5R與G8R的相互作用。J1R與病毒的形態(tài)發(fā)生有關(guān)，Chiu W L［15］等應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，J1R在牛痘病毒感染后，可以與自身發(fā)生相互作用，其N－端序列（1－77）和 C－端序列（84－153）結(jié)合，影響病毒的組裝。Johnston S C［16］應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)，檢測(cè)到痘病毒蛋白F12（氨基酸351～458）和A36（氨基酸91～111）存在相互作用。用 GST pull－down進(jìn)一步驗(yàn)證，F(xiàn)12和A36是細(xì)胞內(nèi)折疊病毒體（intracellular enveloped virions，IEV）－特異的病毒蛋白，它們的相互作用發(fā)生在IEV形成之后，且F12有可能是在IEV釋放時(shí)起作用。這些轉(zhuǎn)錄因子在相互作用較為復(fù)雜，通過(guò)鑒定這些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合順序，進(jìn)而可以推測(cè)它們的具體作用機(jī)制。

2．2 痘病毒蛋白與宿主蛋白之間的相互作用 病毒的生活周期依賴宿主蛋白的表達(dá)，病毒感染始于病毒侵入被感染的細(xì)胞中，在這一過(guò)程中，同樣有多種蛋白質(zhì)之間的相互作用。在病毒致病的過(guò)程中，病毒編碼的蛋白質(zhì)與宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間的相互作用起著重要的作用，尋找與病毒蛋白質(zhì)相互作用的宿主蛋白將有助于闡明不同病毒致病的分子機(jī)制。研究這些復(fù)雜的蛋白間相互作用引起的功能特性，對(duì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞骨架信息和先天性免疫應(yīng)答等的機(jī)制研究有很重要的意義，同時(shí)有利于進(jìn)一步研發(fā)阻斷這一過(guò)程的活性物質(zhì)，從而達(dá)到治療疾病的目的。

痘病毒屬基因組高度保守，如在痘苗病毒（VACV）中，超過(guò)90%的主要ORFs有高度的的相似性，但也有一些基因只在特定的病毒成員中表達(dá)。Mohamed R［17］應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定出天花病毒（VARV）中與人體細(xì)胞蛋白相互作用的蛋白。采用VARV－特異的14種ORFs（D8L，C18L，A27L，A39L，B4L，B9R，B10R，B11R，B14L，B19R，B20R，B22R，G1R和G2R）作為誘餌，用來(lái)篩選4種人不同組織的cDNA文庫(kù)（扁桃體，乳腺癌，前列腺癌，脾臟）。在14種 VARV蛋白中，只有3種ORFs（B22R，G1R，G2R）編碼蛋白與人組織蛋白存在相互作用［17］。在研究中，Mohamed R 確定了VARV G1R分別與 NF－кB1和Skp1A之間的聯(lián)系，并且進(jìn)一步證明了在瞬時(shí)感染的細(xì)胞中，VARV G1R（正痘病毒屬相關(guān)的家族成員）具有抑制NF－кB信號(hào)通路的作用［17］。

Zhang L［18］等利用酵母雙雜交系統(tǒng)技術(shù)對(duì)牛痘病毒和人蛋白的相互作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究。采用33種牛痘病毒蛋白作為誘餌，用來(lái)篩選4種人類不同組織的cDNA文庫(kù)（扁桃體，乳腺癌，前列腺癌，脾臟），得到109種新的牛痘病毒－人蛋白相互作用組，采用GST pull－down進(jìn)行驗(yàn)證，得到17種牛痘病毒蛋白和酵母雙雜交系統(tǒng)篩選所得結(jié)果一致。這些數(shù)據(jù)為探索未知的信號(hào)通路，如病毒的復(fù)制，宿主趨向性及治病機(jī)理提供了新的線索。

痘病毒蛋白與宿主細(xì)胞蛋白之間的作用對(duì)于病毒入侵細(xì)胞具有重要作用［19］。痘病毒的基因組較大，相對(duì)其他的病毒來(lái)說(shuō)，可以編碼大量蛋白，部分蛋白已被證明有明確的靶點(diǎn)可以控制重要的代謝過(guò)程［20－22］。然而，大多數(shù)蛋白質(zhì)之間的相互作用，在感染的細(xì)胞中，其功能并不明確，因此研究這些痘病毒蛋白與宿主蛋白相互作用具有重要意義。如，牛痘病毒在其宿主范圍決定蛋白CP77缺失的時(shí)候不能感染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。Y2H分析結(jié)果提示，CP77（1～234）和HMG20A具有相互作用，進(jìn)一步的研究證明，在病毒復(fù)制中，CP77能促進(jìn)HMG20A與病毒基因組的分離［23］。Sharp T V［24］應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)牛痘病毒的另一個(gè)宿主范圍基因，E3L，基因產(chǎn)物為pE3，與蛋白激酶（protein kinase，PKR）有直接的相互作用。PKR中具有調(diào)節(jié)作用的氨基端1～99區(qū)，與pE3結(jié)合形成非活性二聚體，競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)表明，pE3通過(guò)與PKR的羧基端367～523區(qū)結(jié)合，阻斷了PKR與翻譯起始因子（eIF2a）之間的相互作用。病毒感染后，在細(xì)胞質(zhì)中，E3L結(jié)合dsRNA，從而抑制并阻斷dsRNA的PKR和2′－5′－寡腺苷酸合成酶的活性［25－27］。Rogan S，利用酵母雙雜交系統(tǒng)，推測(cè)細(xì)胞核蛋白SUMO－1（又名PIC－1，sentrin或 GMP－1）和細(xì)胞質(zhì)核糖體蛋白分別與E3結(jié)合發(fā)揮作用，但是缺乏對(duì)其功能的深入研究［28］。另外，Sperling K M［29］應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定了與MVA編碼的68KANK蛋白發(fā)生相互作用的蛋白，99%的陽(yáng)性結(jié)果分析都是細(xì)胞Skep1（泛素連接酶復(fù)合物中的組成成分）。68KANK包含一個(gè) C－末端 F－box－like區(qū)，已有文獻(xiàn)證明它與Skep1結(jié)合。Mohan K V［30］應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)，以VACV中的神經(jīng)毒力因子N1L篩選人腦cDNA文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)N1L的C末端227個(gè)氨基酸與人腦細(xì)胞基底膜相關(guān)硫酸軟骨素蛋白多糖（bamacan）存在相互作用，這種相互作用在病毒感染的N1L哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到證實(shí)。進(jìn)一步研究表明，這種病毒蛋白之間的相互作用，可促進(jìn)病毒生長(zhǎng)，并可能影響VACV在神經(jīng)細(xì)胞中的毒力［30］。Lin Y C［31］應(yīng)用Y2H檢測(cè)與VACV連接酶（A50R基因）相互作用的宿主蛋白，篩選到了拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，應(yīng)用Co－IP方法證實(shí)，在感染的細(xì)胞中，天然的連接酶和Flag－標(biāo)記的重組蛋白與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ形成復(fù)合體，這種相互作用很好的解釋了依托泊苷和米托蒽醌對(duì)痘病毒復(fù)制的抑制作用及突變發(fā)生后的耐藥性。

除了牛痘病毒基因組，酵母雙雜交系統(tǒng)也用于篩選粘液瘤病毒（MYXV）中的一些基因編碼蛋白與宿主蛋白之間的相互作用。MYXV中 M－T5，M148，M149和M150都包含有一個(gè)PRANC區(qū)，與細(xì)胞F－box區(qū)結(jié)構(gòu)相似，且都編碼ANK重復(fù)序列，ANK重復(fù)序列與Skep1存在相互作用［32］。MT5的N－末端ANK重復(fù)區(qū)在與Akt發(fā)生相互作用時(shí)起作用，而C－末端PRANC／F－box區(qū)與Skep1存在相互作用，但之前已經(jīng)確定與M－T5相結(jié)合的蛋白即cullin－1［33］和 Akt［34］在酵母雙雜交系統(tǒng)中卻未篩選到，在宿主SCF（Skep1，culling，F(xiàn)－box－con－taining復(fù)合物）泛素連接酶復(fù)合物中，M－T5通過(guò)Skep1與cullin－1相互作用，形成M－T5的相互作用圖譜，為進(jìn)一步了解病毒在復(fù)制中的具體機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

在接觸傳染性軟疣病毒中的研究中，Chen N［35］應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn) MC013L與糖皮質(zhì)激素和維他命D受體有相互作用。糖皮質(zhì)激素具有潛在的抑制細(xì)胞周期的作用，維他命D具有促進(jìn)細(xì)胞終末分化的作用，因此，推測(cè)MC013L可能通過(guò)抑制感染細(xì)胞的分化促進(jìn)細(xì)胞復(fù)制。Bertin J 應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)MC159蛋白可與FADD相互作用，而且，MC159抑制由Fas和TNFR1引起的凋亡。

3 酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)和不足

3．1 酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì) 目前，酵母雙雜交系統(tǒng)在研究蛋白質(zhì)之間的相互作用中有大范圍的應(yīng)用。對(duì)于一些病毒蛋白在復(fù)雜的生命過(guò)程中不能明確其潛在靶點(diǎn)，酵母雙雜交技術(shù)就是一種很有利的方法，Mohan K V［30］應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)得到VACV中的神經(jīng)毒力因子N1L相互作用的蛋白。酵母雙雜交技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)為：簡(jiǎn)單快速、敏感并適用于高通量；在高等的真核細(xì)胞中檢測(cè)，直接通過(guò)重組轉(zhuǎn)錄因子作用的激活，在培養(yǎng)基中顯色及或通過(guò)其營(yíng)養(yǎng)缺陷進(jìn)行篩選，無(wú)須進(jìn)行蛋白純化；通過(guò)構(gòu)建一定庫(kù)容量的文庫(kù)，篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，如Zhang L［18］以33種牛痘病毒蛋白為誘餌篩選4種人類不同組織的cDNA文庫(kù)。

3．2 局限性與改進(jìn)發(fā)展 酵母雙雜交技術(shù)的缺陷在于：一方面存在大量的假陽(yáng)性結(jié)果，也就是蛋白質(zhì)之間的相互作用在酵母細(xì)胞中是非特異性的［37］。因此，確定酵母雙雜交系統(tǒng)所得到的結(jié)果，還必須與其他的研究蛋白質(zhì)之間相互作用的方法（如：表面等離子體共振，免疫共沉淀等）相結(jié)合。比如，Zhang L［18］在酵母雙雜交技術(shù)篩選文庫(kù)后，又對(duì)這些相互作用組進(jìn)行GST pull－down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其一致率為63%。另一方面，酵母雙雜交技術(shù)也存在假陰性結(jié)果，如在 Mccraith S［10］的研究中，痘病毒中37種相互作用組，是病毒生命周期中的一小部分，若使用其他酵母雙雜交系統(tǒng)，如，不依賴于細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)的系統(tǒng)，這一相互作用組數(shù)量將會(huì)增加。盡管有這些缺陷，利用酵母雙雜交技術(shù)得到的結(jié)果，為發(fā)現(xiàn)新的病毒－病毒或病毒－宿主蛋白之間的相互作用，提供了很多有意義的線索。并且，研究人員在經(jīng)典的酵母雙雜交原理基礎(chǔ)上創(chuàng)建了很多新的方法和系統(tǒng)以彌補(bǔ)這些缺陷。近年來(lái)，以Y2H基本原理為基礎(chǔ)的酵母雙雜交系統(tǒng)衍生系統(tǒng)幾乎可以應(yīng)用于細(xì)胞蛋白組學(xué)。

4 總結(jié)與展望

到目前為止，酵母雙雜交系統(tǒng)仍然是研究痘病毒與機(jī)體相互作用的主要手段之一，今后利用酵母雙雜交及其改良系統(tǒng)對(duì)痘病毒的研究主要集中于以下幾點(diǎn)：①確定痘病毒的具體功能蛋白與機(jī)體的多種蛋白相互作用，進(jìn)而構(gòu)建與痘病毒某一蛋白的機(jī)體反應(yīng)蛋白網(wǎng)絡(luò)，組建體外機(jī)體的作用蛋白系統(tǒng)；②根據(jù)確定的痘病毒執(zhí)行類似功能的一組蛋白，進(jìn)行群體蛋白與機(jī)體細(xì)胞蛋白反應(yīng)的篩選，獲得機(jī)體對(duì)痘病毒某一生理功能的作用和拮抗蛋白群；③利用機(jī)體的某一特殊蛋白為誘餌，反向篩選痘病毒的功能蛋白群，從而為防控痘病毒病提供理論基礎(chǔ)。相信隨著研究的深入，酵母雙雜交系統(tǒng)在痘病毒研究中的應(yīng)用會(huì)更加廣泛，也會(huì)為人類防控痘病毒病發(fā)揮應(yīng)有的作用。

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