王雪敏，姚建楠，，李蓓蓓，楊傳定，邵東華，王少輝，馬志永

甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin－resistantStaphylococcusaureus，MRSA）目前已經(jīng)成為醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的主要病原菌之一，它可以引起人的心內膜炎、肺炎、菌血癥等致死性感染[1]。近年來，MRSA的臨床分離率呈明顯上升趨勢，并且對臨床使用的多種常用抗菌藥物表現(xiàn)出交叉耐藥和多重耐藥的特點，這給臨床治療帶來了嚴峻挑戰(zhàn)。MRSA的耐藥機制主要是獲得了外源性甲氧西林決定子基因（methicillin－resistant determinant A，mecA），該基因編碼青霉素結合蛋白2α，造成對所有β－內酰胺類藥物耐藥。而SCCmec是一種可移動的遺傳元件，該元件還攜帶除mecA基因外的其他抗生素耐藥基因，造成多重耐藥。SCCmecⅠ，Ⅱ，Ⅲ型主要存在于醫(yī)院獲得性MRSA（Hospitalacquired／associated MRSA，HA－MRSA）中，該菌種中mecA復合體的下游帶有多個質粒及轉座子。SCCmecIV型和SCCmecV型通常存在于社區(qū)獲得性 MRSA（Community－acquired／associated MRSA，CA－MRSA）和非多重耐藥 MRSA菌株中，其分子較小，除mecA外幾乎不攜帶其他多重耐藥基因，易移動并通過質?；蚴删w傳播至不同遺傳背景的葡萄球菌中，容易在人群中傳播和定植。殺白細胞素（Panton－Valetine Leukocidin，PVL）是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種可以導致壞死性感染的細胞外毒素，嚴重時可以引起人的壞死性肺炎等[2]。近年來，MRSA流行病學發(fā)生很大變化，出現(xiàn)了另一類導致人類嚴重感染的牲畜相關性 MRSA（Livestock－associated MRSA，LA－MRSA），已有多篇文獻報道LA－MRSA能夠在豬和人之間傳播[3－5]，所以豬源MRSA引起了全世界的廣泛關注。本研究通過調查上海地區(qū)豬源MRSA的流行狀況、耐藥譜特征及其SCCmec基因分型特點，闡明上海地區(qū)豬源MRSA的流行情況及其主要的流行型，以期指導豬場合理用藥，同時為動物源MRSA向人傳播的風險評估提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品及標準菌株來源 于2011年8月—2012年5月分別在上海市5個規(guī)?；i場和1個屠宰場，采集豬鼻腔拭子樣品共計232份。質控菌株ATCC 29213來源于本實驗保存。

1.2 主要試劑及抗生素來源 MH肉湯，腦心浸液培養(yǎng)基 （BHI），7.5% 氯 化 鈉 肉 湯 （7.5%Sodium Chloride Broth）均購自青島海博生物技術有限公司；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基購自上海市科瑪嘉微生物技術有限公司；抗生素阿奇霉素（AZI）、紅霉素（ERY）、氯霉素（CHL）、氟苯尼考（FLO）和諾氟沙星（NOR）購自山西恒豐強動物藥業(yè)有限公司；慶大霉素（GEN）購自濮陽泓天威藥業(yè)有限公司；頭孢噻呋（CEF），萬古霉素（VAN）購自浙江海正有限公司；利奈唑胺（LNZ），瑞他怕林（REP）購自上海景顏化工科技有限公司；苯唑西林（OXA），沃尼妙林（VAL），泰妙菌素（TIA），阿米卡星（AMK）購自浙江康恩貝股份有限公司；2×Taq PCR MasterMix，2 000bp DNA Ladder Marker及細菌基因組提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司（北京）。

1.3 引物 本研究使用引物（見表1）均由英俊生物技術有限公司（上海）合成。

1.4 DNA的提取 根據(jù)細菌基因組DNA提取試劑盒（天根）說明書提取，－20。C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5SA和MRSA的分離鑒定 將采集的豬鼻腔拭子浸出液先接種于7.5%氯化鈉肉湯中，37。C，200 r／min搖床培養(yǎng)12～16h，然后劃線于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)24h，再挑取疑似菌落接種于BHI培養(yǎng)基中37。C培養(yǎng)12～16h。nuc基因和mecA基因進行雙重PCR鑒定SA或MRSA。

1.6 MRSA 的耐藥性檢測 參照 CLSI[7]標準用肉湯稀釋法測定藥物最小抑制濃度（MIC）。

1.7 SCCmec基因分型 SCCmec基因分型采用多重PCR，引物及反應條件參照文獻[7]。

1.8PVL基因檢測 采用20μL反應體系，體系參數(shù)為：2×Taq PCR MasterMix（天根）10μL，DNA模板0.5μL，PVL基因上下游引物[8]各0.5 μL，去離子水8.5μL。PCR循環(huán)參數(shù)為95。C預變性4min，94。C40s、55。C30s、72。C1min，共31個循環(huán)，72。C終延伸7min，對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測。

2 結果與討論

2.1 SA和MRSA的分離鑒定 232個樣品通過7.5%氯化鈉肉湯預增菌，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基顯色培養(yǎng)及雙重PCR方法分離得到139株SA，其中70株MRSA，占總樣品數(shù)的30.2%（70／232），與已報道的國內豬群中MRSA檢出率比較，高于河北地區(qū)（25.0%），明顯高于湖北地區(qū)（12.1%），陜西地區(qū)（8.5%），四川地區(qū)（1.6%）等[9]。值得注意的是本研究各個豬場間MRSA檢出率不盡相同，尤其以浦東地區(qū)的檢出率最低（表2）。存在這種差異性的原因可能與各個豬場豬的來源、抗生素的使用、喂養(yǎng)的方式、環(huán)境因素等有關。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

表2 上海地區(qū)SA及MRSA檢測結果Tab.2 Isolation results of SA and MRSA in Shanghai areas

2.2 MRSA抗菌藥物耐藥性及SCCmec基因分型

豬源MRSA對14種常用抗生素的耐藥性，表現(xiàn)出交叉耐藥和多重耐藥的特點。除對LNZ、VAN和AMK全部敏感外，對CEF、GEN和NOR耐藥率分別為74.3%，62.9%和42.9%；對 AZI、ERY、CHL、FLO和OXA耐藥率100%，對重要人醫(yī)用藥REP和重要畜禽專用藥VAL和TIA也全部耐藥。MRSA對14種抗生素的耐藥數(shù)據(jù)見表3。MRSA的多重耐藥一直是臨床治療面臨的難題，伴隨著近年來MRSA分離率增加，這一問題顯得尤為突出。從本研究藥敏試驗結果可以看出，豬源MRSA的耐藥率很高，除了對LNZ、VAN和AMK敏感外，其余11種都有耐藥，且多表現(xiàn)為多重耐藥。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)所有MRSA菌株對截短側耳類藥物REP，VAL和TIA表現(xiàn)出高水平耐藥。截短側耳類藥物是在天然化合物截短側耳素（pleuromutilin）的基礎上進行化學修飾改造獲得的一類抗菌藥物。該類藥物的代表泰妙菌素和沃尼妙林是畜禽專用藥，用于獸醫(yī)臨床上多種細菌感染的治療。近年來興起了開發(fā)新的截短側耳類衍生物用于治療人類細菌感染。Retapamulin是第一個用于人醫(yī)的截短側耳類藥物，2007年被批準用于由金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球菌引起的皮膚感染和傷口感染。研究表明，REP耐藥株在人源金黃色葡萄球菌中檢出率非常低（5 676株中僅6株表現(xiàn)敏感性降低或者耐藥[10]），這也說明該類藥物在人醫(yī)上的開發(fā)潛力巨大。與人源相比，動物源金黃色葡菌對截短側耳類藥物的耐藥情況則非常嚴重。在對瑞士2009—2010年間分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的研究中發(fā)現(xiàn)，90%的菌株對泰妙菌素耐藥[11]。在德國GERM－Vet項目中分離到的68株MRSA中有9株檢測到對截短側耳類藥物的耐藥。這些菌株不僅來源于豬，而且還分離自牛、火雞以及零售肉制品[12]。本實驗所有豬源 MRSA菌株對3種截短側耳類藥物全部表現(xiàn)高水平耐藥，應引起我們足夠重視，這也提示我們要防控動物源耐藥菌／耐藥基因通過食物鏈或者環(huán)境向人類的傳播，否則一些類似于REP的新型抗菌藥物在人醫(yī)上的應用前景將大打折扣。

本研究是首次對上海地區(qū)豬源MRSA耐藥基因進行分型，結果發(fā)現(xiàn)所有豬源MRSA SCCmec分型均為Ⅳb型，與王新等報道的陜西地區(qū)豬源MRSA SCCmec基因型一致，與崔生輝等[9]報道的四川地區(qū)（SCCmecⅢ型），河北地區(qū)（SCCmecⅢ型），湖北地區(qū)（SCCmecⅢ型）豬源MRSA分型不一致。本次試驗并未檢測到PVL毒力基因。根據(jù)文獻報道我國人源醫(yī)院相關性 MRSA（Hospital－acquired／associated MRSA，HA－MRSA）主要流行SCCmecⅢ型，并且具有交叉耐藥和多重耐藥的特點[13－14]。另一類社區(qū)相關性 MRSA（Community－acquired／associated MRSA，CA－MRSA）則主要流行 SCCmecⅣ和SCCmecⅤ型，但為非多重耐藥性菌株[14]。本研究結果顯示SCCmecⅣb型的豬源MRSA的耐藥性嚴重，不同于SCCmecⅣ型的非多重耐藥性CA－MRSA，推測豬源MRSA可能存在其他耐藥機制，還有待進一步的研究證明。這也警示我們應該謹防豬源MRSA通過食物鏈或環(huán)境向社區(qū)傳播，否則一些非多重耐藥性CA－MRSA成為耐藥性菌株，對公共衛(wèi)生和人類健康構成嚴重威脅。

表3 MRSA對14種抗生素的耐藥數(shù)據(jù)Tab.3 Antimicrobial susceptibility data of MRSA to 14antibiotics

[1]Duijkeren EV，Jansen MD，F(xiàn)lemming SC，et al.Methicillin－resistantStaphylococcusaureusin pigs with exudative epidermitis[J].Emerg Infect Dis，2007，13（9）：1408－1410.DOI：10.321／eid1309.061268

[2]Du N，Hu BJ，Chu YZ.Detection of SCCmectyping and toxic genes of methicillin－resistantStaphylococcusaureusat five teaching hospitals in China[J].Chin J Lab Med，2007，30（5）：499－504.（in Chinese）杜娜，胡比杰，褚云卓.我國五家教學醫(yī)院耐甲氧西林金黃色葡萄球菌SCCmec分型及毒素基因的檢測[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2007，30（5）：499－504.

[3]Duijkeren EV，Ikawaty R，Broekhuizen－Stins MJ，et al.Transmission of methicillin－resistantStaphylococcusaureusstrains between different kinds of pig farms[J].Vet Microbiol，2008，126（4）：383－389.

[4]Khanna T，F(xiàn)riendship R，Dewery C，et al.Methicillin resistantStaphylococcusaureuscolonization in pigs and pig farmers[J].Vet Microbiol，2008，128：298－303.

[5]Smith TC，Male MJ，Harper AL，et al.Methicillin－resistantStaphylococcusaureus（MRSA）strain ST398is present in midwestern U.S.swine and swine workers[J].PLoS One，2008，4（1）：e4258.DOI：10.1371／journal.pone.0004258

[6]Merlino J，Watson J，Rose B，et al.Detection and expression of methicillin／oxacillin resistance in multidrug－resistant and nonmultidrug－resistantStaphylococcusaureusin Central Sydney，Australia[J].J Antimicrob Chemother，2002，49（5）：793－801.DOI：10.1093／jac／dkf021

[7]Zhang KY，Mcclure JA，Elsayed S，et al.Methicillin－resistantStaphylococcuschromosomemectypes I to V in subtyping of staphylococcal cassette characterization and concomitant novel multiplex PCR assay for aureus[J].J Clin Microbiol，2005，43（10）：5026－5033.DOI：10.1128／JCM.43.10.5026－5033.2005

[8]Mcclure JA，Conly JM，Lau V，et al.Novel multiplex PCR assay for detection of the staphylococcal virulence marker panton－valentine leukocidin genes and simultaneous discrimination of methicillin－susceptible from－resistantStaphylococci[J].J Clin Microbiol，2006，44（3）：1141－1144.DOI：10.1128／JCM.44.3.1141－1144.2006

[9]Cui SH，Li JY，Hu CQ，et al.Isolation and characterization of methicillin－resistantStaphylococcusaureusfrom swine and workers in China[J].J Antimicrob Chemother，2009，64：680－683.DOI：10.1093／jac／dkp275

[10]Gentry DR，Closkery LM，Gwynn MN，et al.Genetic characterization of Vga ABC proteins conferring reduced susceptibility to pleuromutilins inStaphylococcusaureus[J].Antimicrob A－gents Chemother，2008，52（12）：4507－4509.DOI：10.1128／AAC.00915－08

[11]Schwendener S.New transposonTn6133in methicillin－resistantStaphylococcusaureusST398contains vga（E），a novel streptogramin A，pleuromutilin，and lincosamide resistance gene[J].Antimicrob Agents Chemother，2011，55（10）：4900－4904.DOI：10.1128／AAC.00528－11

[12]Kadlec K，Pomba CF，Couto N，et al.Small plasmids carrying vga（A）or vga（C）genes mediate resistance to lincosamides，pleuromutilins and streptogramin A antibiotics in methicillin－resistantStaphylococcusaureusST398from swine[J].J Antimicrob Chemother，2011，28：1－2.DOI：10.1093／jac／dkq365

[13]Cui XG，Wei J，Jia W，et al.Detection of leukocidin gene in methicillin－resistantStaphylococcusaureusform burn department and molecular epidemiology of SCCmec[J].Chin J Nosocomio，2012，22（13）：2721－2723.（in Chinese）崔學光，魏軍，賈偉，等.燒傷科耐甲氧西林金黃色葡萄球菌殺白細胞素基因檢測及SCCmec分子流行病學調查[J].中華醫(yī)院感染性雜志，2012，22（13）：2721－2723.

[14]Stefani S，Chung DR，Lindsay JA，et al.Meticillin－resistantStaphylococcusaureus（MRSA）：global epidemiology and harmonisation of typing methods[J].Int J Antimicrob Agents，2012，39：273－282.DOI：10.1016／j.ijantimicag.2011.09.030